- siRNA靶向干扰GPC3基因慢病毒载体的构建及其对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响被引量：2
- 2014年
- 目的构建GPC3基因短发夹干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,观察GPC3基因对人肝癌细胞系Huh-7凋亡的影响,探讨GPC3基因影响肝癌细胞生长的机制,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法采用RNA干扰技术转染肝癌细胞系Huh-7,荧光定量PCR检测GPC3基因在多种肝癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向GPC3基因的小干扰RNA序列PGC-shRNA-GPC3,以脂质体(lipofectamineTM2000)为载体转染人肝癌细胞系,筛选并建立稳定表达siRNA的细胞株。采用RT-PCR及Western blot检测GPC3 siRNA转染后mRNA表达情况,验证siRNA的干扰效率。流式细胞仪检测阴性对照组、未转染组和转染组细胞凋亡的情况。结果在肝癌细胞株Huh-7中,GPC3基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-GPC3重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入肝癌细胞株Huh-7后能明显抑制GPC3 mRNA表达水平;同时,流式细胞仪检测发现,GPC3表达下调后,诱导Huh7细胞的凋亡。结论靶向GPC3的siRNA能有效抑制GPC3的表达,并能促进肝癌Huh7细胞凋亡。
- 雷长江龙浩成李磊姚春曾诚郑刚
- 关键词：慢病毒载体肝癌细胞株
- 沉默GPC3对肝癌Huh-7细胞增生、迁移和侵袭能力的影响
- 2014年
- 目的探讨Hippo通路靶向GPC3后对肝癌Huh-7细胞增生、迁移、侵袭能力的影响。方法采用Western blot检测法及RT-PCR分别测量肝癌Huh-7不同对数生长期的肝癌细胞株GPC3蛋白表达水平及GPC3 mRNA水平,并筛选出可有效沉默GPC3基因的siRNA。将肝癌Huh-7细胞株分为实验组、未转染组及对照组,实验组导入GPC3-siRNA-1633转染Huh-7,其余两组不作处理。EdU实验检查三组细胞增殖率,划痕实验测定各组细胞迁移率,Transwell实验测定各组细胞侵袭能力。结果实验组GPC3 mRNA表达量及GPC3蛋白水平显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组Hippo通路中YAP mRNA表达量显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。转染48 h后,实验组细胞增生率、迁移率及侵袭率显著低于未转染组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 GPC3可促进肝癌Huh-7细胞增殖、侵袭及转移,从而促进肝癌细胞生长。CPG3可通过上调Hippo通路中YAP表达水平从而促进肝癌细胞增生。通过沉默GPC3 mRNA后可有效抑制肝癌Huh-7细胞生长。
- 雷长江李磊龙浩成曾诚黄剑彬
- 关键词：细胞增殖GPC3
- Glypican-3、TNF-α在原发性肝细胞癌中的表达及其与预后的关系被引量：2
- 2015年
- 目的探讨磷脂酰肌醇蛋白-3(GPC-3)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)在原发性肝细胞癌(HCC)患者血清中的水平及其对预后的影响。方法选择2010年1月至2013年12月期间60例原发性肝癌患者为研究对象。60例原发性肝癌中原发性HCC 40例,原发性肝内胆管细胞癌20例。40例患者按HCC临床分期:早期HCC 18例,中晚期HCC 22例;按HCC预后好坏:死亡(预后不良组)8例,存活(预后较好组)32例。选择30例肝硬化患者为疾病对照组,选择健康者60例为对照组。统计受试者血清GPC-3、TNF-α水平,并对血清GPC-3、TNF-α与年龄、预后、HCC临床分期、肝癌病理类型、BMI进行相关性分析。结果 HCC组血清GPC-3、TNF-α水平高于肝硬化组和对照组,差异有统计学意义(P<0.01),肝硬化组和对照组血清GPC-3、TNF-α水平无明显差异(P>0.05);不同病理类型肝癌之间血清GPC-3、TNF-α水平存在明显差异,HCC组血清GPC-3、TNF-α水平高于肝内胆管细胞癌组和健康对照组,差异有统计学意义(P<0.01),肝内胆管细胞癌组和对照组血清GPC-3、TNF-α水平无明显差异(P>0.05);中晚期、早期HCC患者血清GPC-3、TNF-α水平存在明显差异。随着HCC的进展,血清GPC-3、TNF-α水平呈上升趋势,且中晚期、早期、对照组三组间两两比较均有统计学差异(P<0.01);不同预后HCC患者血清GPC-3、TNF-α水平存在明显差异,预后不良组患者血清GPC-3、TNF-α水平高于预后较好组,且预后不良组、预后较好组、对照组三组间两两比较均有统计学差异(P<0.01);血清GPC-3、TNF-α水平与HCC临床分期、肝癌病理类型均呈正相关(P<0.05);血清GPC-3、TNF-α水平与HCC预后均呈负相关(P<0.05);血清GPC-3、TNF-α与年龄、BMI等因素无明显相关性(P>0.05)。结论 GPC-3、TNF-α在HCC患者血清中呈现高表达,GPC-3、TNF-α的表达与HCC发病、进展及预后密切相关。
- 陈春洲龙浩成雷长江李磊曾诚黄剑彬
- 关键词：肝细胞肿瘤坏死因子Α预后
- 超声辐照携带miR-520c-3p和miR-132微泡对体外培养人肝癌细胞Huh7的影响被引量：3
- 2017年
- 目的:观察超声辐照携带miR-520c-3p和miR-132微泡对体外培养人肝癌细胞Huh7的影响。方法:以超声辐照携带miR-520c-3p和miR-132微泡转染体外培养人肝癌Huh7细胞株。实验分5组:对照组(A组),miR-520c-3p mimics negative control+miR-132 mimics negative control+微泡造影剂+超声辐照(B组),miR-520c-3p mimics+微泡造影剂+超声辐照(C组),miR-132 mimic+微泡造影剂+超声辐照(D组),miR-520c-3p mimics+miR-132 mimics+微泡造影剂+超声辐照(E组)。超声辐照条件:机械指数0.4,辐照参数2.0 W/cm2,连续辐照30 s,间隔60 s,共5次。采用实时荧光定量PCR检测miR-520c-3p,miR-132,磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)和转录辅助因子YAP m RNA表达,采用Western印迹检测GPC3和YAP蛋白表达,采用噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性,采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:与A组、B组比较,C组、E组miR-520c-3p相对表达量升高(P<0.05),而D组无明显改变(P>0.05);D组、E组miR-132相对表达量升高(P<0.05),而C组无明显改变(P>0.05)。与A组、B组比较,C组、E组GPC3蛋白相对表达量降低(P<0.05),而其m RNA相对表达量无明显改变(P>0.05)。C组、D组、E组YAP蛋白以及其m RNA相对表达量均降低(P<0.05)。与A组、B组比较,C组、D组、E组细胞增殖率降低(P<0.05),且E组降低最明显(P<0.05);C组、D组、E组细胞凋亡率增加(P<0.05),且E组凋亡最明显(P<0.05)。结论:超声辐照携带miR-520c-3p和miR-132微泡能显著抑制人肝癌Huh7细胞株增殖,并促进其凋亡,其机制可能与调节GPC3和YAP的表达有关。
- 潘青云雷长江李媛胡福荣李磊黄剑彬曾诚
- 关键词：超声辐照肝细胞癌磷脂酰肌醇蛋白多糖-3
- MiR-132靶向YAP抑制肝癌Huh7细胞的生长被引量：2
- 2014年
- 目的研究miR-132靶向YAP后对肝癌Huh7细胞生长的抑制,为临床治疗肝癌的方法提供新的理论依据。方法实验分为三组:未转染miR-132的Huh7细胞组(control组),阴性对照组(miR NC组)以及转染miR-132的Huh7细胞组(miR-132组),通过RT-PCR检测YAP mRNA表达情况;通过流式细胞仪检测细胞凋亡改变;通过Edu检测细胞增殖能力;通过Transwell法检测细胞侵袭能力。结果 RT-PCR检测YAP mRNA发现miR-132可明显抑制YAP基因在肝癌细胞株Huh7中的表达,control组、miR NC组和miR-132组YAP mRNA的相对表达量为1.000 0±0.024 1、0.942 6±0.024 8和0.257 3±0.045 8(P<0.05);流式细胞仪检测发现转染miR-132后能明显促进肝癌Huh7细胞的凋亡,control组、miR NC组和miR-132组Huh7细胞总凋亡为4.03±0.35、4.53±0.26和13.62±0.49(P<0.05);EdU检测发现转染miR-132后肝癌Huh7细胞增殖能力明显受抑制,control组、miR NC组和miR-132组分别为(65.12±1.93)%、(64.02±0.87)%和(42.00±1.26)%(P<0.05);traswell检测结果发现转染miR-132后肝癌Huh7细胞侵袭能力明显受抑制,control组、miR NC组和miR-132组分别为3.35±0.13、0.72±0.06和0.48±0.03(P<0.05)。结论 miR-132具有抑制肝癌细胞生长的作用,并有可能通过靶向YAP而下调其表达起作用。
- 雷长江龙浩成李磊姚春曾诚郑刚
- 关键词：肝癌细胞细胞生长
- Yes相关蛋白在人肝细胞肝癌中表达及意义被引量：4
- 2015年
- 目的探讨Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)在肝细胞肝癌组织中的表达,以及其与临床病理特征、甲胎蛋白(alpha-fetal protein,AFP)的关系,评价其在肝细胞肝癌早期诊断中的意义。方法应用免疫组织化学方法检测52例肝细胞肝癌患者手术切除肝癌组织(观察组),43份癌旁正常肝组织(对照组)YAP表达情况;应用Western blot法检测25例肝癌患者(肝癌组)和26例正常人(正常组)血清YAP蛋白;应用诊断试验评价YAP蛋白单独及其联合AFP诊断肝细胞肝癌的价值。结果 (1)观察组YAP表达阳性率为80.77%,对照组为9.30%,2组比较差异有统计学意义(P<0.01);(2)观察组YAP阳性表达在性别、年龄、肿瘤直径、有无静脉侵犯和肿瘤分期上差异无统计学意义(P>0.05),而在肿瘤分化程度上差异有统计学意义(P<0.05);(3)观察组YAP阳性程度与患者血清AFP水平呈正相关(r=0.536,P=0.001);(4)肝癌组血清YAP蛋白相对表达量(0.629 2±0.065 9)高于正常组(0.020 0±0.034 0)(P<0.05);(5)YAP蛋白+AFP联合检测的灵敏度(92.0%)高于单独YAP(72.0%)和单独AFP(64.0%)检测的灵敏度(P<0.05);YAP蛋白+AFP联合检测的特异度(92.3%)与单独YAP(96.2%)、AFP(88.5%)检测的特异度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 YAP在肝细胞肝癌发生、发展中起重要作用;联合检测血清YAP蛋白和AFP可提高肝细胞肝癌诊断率;YAP可作为肝细胞肝癌筛选、检测和随访的可靠血清学指标之一。
- 雷长江李磊龙浩成王斌曾诚黄剑彬
- 关键词：肝细胞肝癌免疫组织化学WESTERNBLOT法
- 肝癌组织中基质金属蛋白酶表达与侵袭转移的关系研究被引量：6
- 2015年
- 目的检测肝癌患者血液及组织中MMP-2、MMP-9的表达,分析二者与肝癌侵袭转移的关系。方法选取2013年1月至2014年10月在我院住院行手术切除的肝细胞癌(HCC)患者40例作为试验组,经病理确诊为HCC,且未经放、化疗等抗肿瘤治疗;对照组患者40例,包括局灶性增生性结节16例,肝血管瘤13例,肝外伤11例。采用酶联免疫吸附法和免疫组织化学法检测入组患者血液及组织中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表达。结果采用酶联免疫吸附法对两组患者MMP-2、MMP-9的水平进行检测,结果发现,试验组患者血液中MMP-2水平(0.384±0.026)、MMP-9水平(0.337±0.012)明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);采用免疫组织化学法对试验组肝癌组织、癌旁组织、对照组进行MMP-2、MMP-9的检测,结果发现,肝癌组织中MMP-2强阳性(+++)表达30例,MMP-9强阳性(+++)表达31例,阳性率为87.5%、85.0%;癌旁组织无MMP-2、MMP-9强阳性表达,阳性率分别为10.0%、12.5%;对照MMP-2、MMP-9阳性率分别为7.5%、10.0%。试验组肝癌组织MMP-2、MMP-9的表达阳性率较癌旁组织及对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);MMP-2、MMP-9的表达与静脉浸润、肝内外转移、包膜有关(P<0.05),与性别、年龄、病灶大小、肝硬化、甲胎蛋白(AFP)、HBs Ag无关(P>0.05)。结论 MMP-2、MMP-9在肝癌中表达升高,与有无静脉浸润、有无肝内外转移及有无包膜有关,并且出现静脉浸润、有肝内外转移、无包膜的肝癌中,MMP-2、MMP-9表达明显升高,与肝癌的生长、侵袭和转移有密切的关系。
- 陈春洲雷长江李磊曾诚黄剑彬
- 关键词：基质金属蛋白酶类肿瘤浸润肿瘤转移
- 磷脂酰肌醇蛋白多糖-3对Hippo信号通路的调控机制及其对肝癌Huh7细胞生物学行为的影响被引量：2
- 2016年
- 目的探讨磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(GPC3)对Hippo信号通路的调控机制及其对人肝癌Huh7细胞生物学行为的影响。方法分别构建4种靶向GPC3和YAP1基因的sh RNA序列,然后转染入肝癌Huh7细胞,并筛选稳定表达的细胞株。采用荧光定量PCR法和蛋白印迹法检测转染后的Huh7细胞中GPC3和YAP1的表达,以筛选有效沉默GPC3和YAP1的sh RNA。观察沉默GPC3和YAP1以及人重组YAP1(rh YAP1)对肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。GPC3 sh RNA转染实验分为6组:未转染组、空载体组、GPC3-714-sh RNA组、GPC3-647-sh RNA组、GPC3-1718-sh RNA组、GPC3-2134-sh RNA组。YAP1 sh RNA转染实验分为6组:未转染组、空载体组、YAP1-906-sh RNA组、YAP1-1363-sh RNA组、YAP1-1666-sh RNA组、YAP1-2895-sh RNA组。GPC3对YAP1的调控实验分为5组:未转染组、空载体组、GPC3-1718-sh RNA组、GPC3-1718-sh RNA+rh YAP1组、YAP1-1666-sh RNA组。结果 1成功构建了可有效沉默GPC3和YAP1表达的GPC3-1718-sh RNA和YAP1-1666-sh RNA质粒。2 GPC3sh RNA各转染组细胞中GPC3 m RNA和蛋白表达均明显低于未转染组(P<0.05)和空载体组(P<0.05),而GPC3-1718-sh RNA组又明显低于其他转染组(P<0.05)。YAP1 sh RNA各转染组细胞中YAP1 m RNA和蛋白表达均明显低于未转染组(P<0.05)和空载体组(P<0.05),而YAP1-1666-sh RNA组又明显低于其他转染组(P<0.05)。3 GPC3-1718-sh RNA组和YAP1-1666-sh RNA组细胞中YAP1 m RNA和蛋白表达均明显低于未转染组(P<0.05)和空载体组(P<0.05);而GPC3-1718-sh RNA+rh YAP1组细胞中YAP1 m RNA和蛋白表达明显高于GPC3-1718-sh RNA组(P<0.05)和YAP1-1666-sh RNA组(P<0.05)。4与未转染组和空载体组比较,GPC3-1718-sh RNA组和YAP1-1666-sh RNA组的细胞增殖和侵袭能力明显降低(P<0.05),细胞凋亡明显增加(P<0.05);而GPC3-1718-sh RNA+rh YAP1组细胞增殖、侵袭和凋亡均得到明显改善(P<0.05)。结论 GPC3很有可能通过对Hippo信号通路YAP1的调控,实现其对人肝癌细胞Huh7生物学行为的
- 杨民李媛雷长江李磊冯加锐龚小军杨锐
- 关键词：磷脂酰肌醇蛋白多糖-3肝癌细胞
