思兰兰
- 作品数：20 被引量：91H指数：7
- 供职机构：解放军302医院更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金国家自然科学基金国家科技重大专项更多>>
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- 阿德福韦酯治疗失败的慢乙肝患者HBV逆转录酶区新变异rtN236V的表型耐药特点分析
- 刘妍王晓思兰兰陈丽王嫣戴久增姚增涛徐东平
- 文献传递
- 阿德福韦酯治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区新变异rtN236V的表型耐药特点分析被引量：9
- 2013年
- 目的鉴定1例阿德福韦酯(ADV)治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶(RT)区的新变异rtN236V,并分析其表型耐药特点。方法从1例ADV治疗失败患者的血清中提取HBV DNA,采用巢式PCR扩增HBV RT区,将PCR产物克隆到pGEM-Teasy载体,转化JM109细胞。挑选34个阳性克隆进行DNA测序并分析耐药相关突变。构建1.1倍HBV野生株和耐药株重组载体,转染人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后分别加入不同浓度的拉米夫定(LAM)、ADV、恩替卡韦(ETV)和替诺福韦(TDF),转染后第4天收集细胞培养液,采用实时荧光定量PCR法检测不同药物浓度作用下细胞培养上清中HBV DNA的产量,并分析其表型耐药特点。结果该例患者在接受ADV治疗15个月后出现病毒学突破和生化学突破,测序结果显示34个克隆中,20个(58.8%)为rtN236V变异株,11个(32.4%)为rtN236T变异株,2个(5.9%)为野生株,1个(2.9%)为rtA181V+N236V变异株。rtN236T、rtN236V和rtA181V+N236V变异株的相对病毒复制力分别为野生株的89.43%、83.60%和75.44%。表型耐药分析显示:rtN236T株、rtN236V株和rtA181V+N236V株对ADV的敏感性分别为野生株的1/4.75、1/3.10和1/5.10,但对LAM、ETV和TDF均敏感。结论在ADV长期治疗失败的慢性乙型肝炎患者血清病毒池中鉴定了新的变异形式rtN236V,并与rtN236T和rtA181V株伴随存在,该变异降低了病毒的复制力及对ADV的敏感性,可能是一个新的ADV耐药相关变异。
- 王晓刘妍思兰兰陈丽白文林刘立明王嫣许智慧戴久增姚增涛徐东平
- 关键词：肝炎病毒乙型病毒
- 新型中药制剂肃毒星对乙型肝炎病毒体外复制的抑制作用研究被引量：6
- 2014年
- 目的观察新型中药制剂肃毒星对野生和恩替卡韦(ETV)耐药乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用。方法以不同浓度(0、0.0005﹑0.001﹑0.005﹑0.01mg/ml)的肃毒星分别处理HepG2.2.15细胞(D基因型/ayw亚型野生HBV稳定复制细胞系)和HepG2.A64细胞(C基因型/adr亚型ETV耐药HBV稳定复制细胞系),作用时间4d。采用酶联免疫吸附试验检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg含量的变化;提取细胞内病毒核心颗粒,采用实时荧光定量PCR方法检测两种细胞内HBV DNA复制水平的变化。观察不同作用时间下,药物对HBV DNA的抑制作用。结果肃毒星对HepG2.2.15细胞和HepG2.A64细胞内HBV DNA复制和HBsAg、HBeAg的分泌均有明显抑制作用,且具有药物剂量和时间依赖性,最高浓度(0.01mg/ml)的肃毒星对HepG2.2.15细胞内病毒的抑制率达到80.83%,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别达51.00%和64.05%;而对HepG2.A64细胞内HBV DNA抑制率为65.18%,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为32.85%和73.86%。随肃毒星作用时间延长,其对HepG2.2.15细胞HBV DNA的抑制效果增强,但未显示对HepG2.A64细胞内ETV耐药型HBV株病毒抑制率增强的效果。结论体外细胞培养实验中,肃毒星不仅可有效抑制野生HBV复制和抗原分泌,而且对ETV耐药HBV的复制和抗原分泌也具有很好的抑制作用。
- 姚伟明刘妍思兰兰许智慧李鹏高卜绿萍兰金初徐东平
- C基因型恩替卡韦耐药突变HBV稳定复制表达细胞系
- 本发明构建了一种乙型肝炎病毒稳定复制表达细胞系，病毒来源于中国流行的C基因型HBV株，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有核苷类似物恩替卡韦耐药突变位点。本发明通过筛选方法使病毒基因组整合到人类肝癌细胞系HepG2细胞染色体上...
- 刘妍王琳徐东平刘文思兰兰戴久增许智慧
- 文献传递
- 隐匿性乙型肝炎病毒感染患者S基因突变特点分析被引量：14
- 2015年
- 目的分析1例血清HBV DNA长期阳性但HBsAg阴性的隐匿性乙型肝类病毒感染(OBI)患者HBV S基因突变特点,揭示S基因突变与OBI发生及肝脏疾病进展的关系。方法收集该患者不同时间点的4份血清样本,扩增HBV S基因并进行克隆测序,挑选代表性突变株病毒基因构建重组载体并进行表型分析。结果从该患者4份血清样本中检出多种S基因突变形式,包括前S1区大片段缺失、s126–127"RPCMNCTI"插入突变、sQ129N、s131–133 TSM→NST和经典的sG145R突变等,其中s131–133 TSM→NST在前后4份动态样本的检测病毒克隆中所占比例分别为0%、26%、59%和74%;前S1区大片段缺失在4份样本检测病毒克隆中始终存在,所占比例分别为26%、17%、15%和21%。表型分析发现,sQ129N和s131–133 TSM→NST可以降低抗体对HBsAg的亲和力,增加病毒分泌;与野生株相比,前S1区大片段(nt 3046–3177)缺失病毒株复制力下降了43.7%,表面抗原启动子Ⅱ(SPⅡ)活性下降了97.2%;sG145R可降低病毒的分泌能力。结论此例HBV感染患者的长期OBI临床表现是由于其感染有多种S基因突变病毒株引起,其中一些S基因突变可以影响病毒的表型特点,可能与肝脏疾病进展密切相关。
- 陈建宏刘妍许智慧思兰兰戴久增李奇王帅李进韩聚强徐东平
- 关键词：肝炎病毒乙型突变
- 中国患者C基因型多重耐药突变HBV稳定复制表达细胞系
- 本发明构建了一株从13000余例中国慢性乙肝患者血清中分离得到的多重耐药人HBV的稳定复制细胞系。经实验证实，该细胞系能够持续进行HBV复制并合成分泌特异性抗原和分泌型完整病毒颗粒，能够稳定支持高抗原表达、病毒复制及病毒...
- 徐东平王琳刘妍刘文思兰兰戴久增许智慧李晓东钟彦伟
- 文献传递
- 中国流行的C基因型HBV稳定复制表达细胞系的建立被引量：1
- 2010年
- 目的建立中国流行的C基因型HBV的稳定复制表达细胞系。方法从1例慢性乙肝患者血清中分离克隆得到1株C基因型病毒DNA全序列,以此为模板扩增产生1.3倍体HBV DNA,包含完整基因组(3.2kb)、从1825位点(polyA)至2599位点大小为775bp的3′端冗余序列,以及至1400位点大小为425bp的5′端冗余序列,将其连接改建重组后的pcDNA3.1(+)载体,构建pN31-51-6-1表达质粒,转染肝癌细胞系HepG2。采用ELISA检测HBsAg、HBeAg的瞬时表达情况,选择双高表达细胞孔进一步行G418筛选稳定表达细胞系。通过ELISA、免疫组化、直接免疫荧光流式细胞术以及HBV复制中间体核心颗粒DNA、细胞内cccD-NA、分泌上清中病毒DNA的RT-PCR检测等方法评估稳定细胞克隆的复制表达情况。结果获得1株具有高抗原表达和高复制能力的细胞克隆HepG2-51-6-1,已稳定传代26代。检测HBsAg、HBeAg吸光度(A)值分别为>3.5和1.29;直接免疫荧光流式细胞术证实细胞表面存在s抗原,免疫组化染色可见细胞内病毒表达。分泌到培养上清中的HBV DNA和细胞内的HBV复制中间体水平分别为2.0×104和5.5×105拷贝/ml,HBVccc DNA为6～8拷贝/细胞。结论成功获得HBV-1.3倍体转染的C基因型HBV稳定复制表达细胞系,为研究我国流行HBV的生物特性和抗HBV新药筛选奠定了基础。
- 王琳刘文刘妍纪冬思兰兰钟彦伟徐东平
- 关键词：基因型病毒复制细胞系抗原
- C基因型恩替卡韦耐药突变HBV稳定复制表达细胞系
- 本发明构建了一种乙型肝炎病毒稳定复制表达细胞系，病毒来源于中国流行的C基因型HBV株，其DNA聚合酶/逆转录酶区含有核苷类似物恩替卡韦耐药突变位点。本发明通过筛选方法使病毒基因组整合到人类肝癌细胞系HepG2细胞染色体上...
- 刘妍王琳徐东平刘文思兰兰戴久增许智慧
- 乙型肝炎病毒多聚酶区rt229突变的流行特点及其对病毒复制力的影响被引量：5
- 2010年
- 目的评价乙型肝炎病毒(HBV)多聚酶反转录酶(RT)功能域rt229突变对HBV复制力的影响。方法从慢性HBV感染患者血清中提取HBVDNA,使用PCR扩增RT区及前C区基因,采用直接测序法分析耐药相关位点的突变;克隆患者HBV全长基因组,获得S445-3及S869-4克隆并作为定点突变母本,以产生rt229突变的各种模式。使用无载体介导的方法将含有rt229突变的全长HBV基因组转染入HepG2细胞系中,转染3d后采用Real-TimePCR法定量检测HBV复制中间体水平。结果在受检的6000例患者中,394例(6.57%)存在rt229突变,与拉米夫定(LAM)治疗相关的占78.93%,明显高于其他患者[包括接受阿德福韦酯(ADV)治疗、初治和用药不详者]所占的21.07%。其中rtL229V、rtL229W和rtL229M单独突变分别占全部rt229突变的12.44%、1.78%和4.57%,未发现rtL229F单独突变株;rtL229V、rtL229W、rtL229M、rtL229F与LAM耐药突变共存分别占43.65%、9.14%、9.64%和14.97%;rtL229V、rtL229M与ADV耐药突变共存分别占2.54%和1.27%。复制力评价结果显示,相对于前C区G1896A单独突变株(S869-4),rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F突变将HBV复制力降低至2.92%、8.79%、26.04%和34.80%;相对于LAM耐药株(S445-3),伴随有rtL229V、rtL229W、rtL229M和rtL229F的LAM耐药株的复制力增加了1.18、2.29、2.49和2.51倍。结论 rt229位点的突变可降低HBV的复制力,增强LAM耐药株的复制力;rt229突变可能为LAM耐药突变的补偿突变。
- 纪冬刘妍思兰兰李乐王琳陈国凤韩萍徐东平
- 关键词：药物耐受性突变抗病毒药
- HBV表型耐药方法的建立及临床分离株的表型耐药分析被引量：6
- 2010年
- 目的建立HBV表型耐药分析方法 ,体外培养慢性乙型肝炎患者血清HBV分离株并系统分析其对拉米夫定(LAM)的敏感性。方法从1例LAM耐药慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增RT基因,克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选10个克隆进行DNA序列测定,并分析RT区LAM耐药相关的突变位点。用XhoI和NcoI双酶切pGEM-Teasy-RT及pTriEx-HBV(C),构建1.1倍HBV野生株和LAM耐药突变株的重组载体pTriEx-wRT和pTriEx-mRT,转染人肝癌细胞系HepG2细胞。转染60h后加入不同浓度(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)的LAM,药物连续作用5d后,抽提病毒核心颗粒HBV DNA,通过实时荧光PCR及Southern blotting检测不同药物浓度作用下HBV DNA的复制水平。结果成功建立体外HBV表型耐药分析方法。野生未突变株重组载体pTriEx-wRT转染HepG2细胞后,随着LAM浓度的升高,HBV DNA水平明显下降,而突变株重组载体pTriEx-mRT转染HepG2细胞后,HBV DNA水平无明显下降,IC50值与野生株相比增加了2500倍。结论建立的HBV表型耐药分析方法对监测HBV耐药性具有可行性。
- 刘禄郝瀚刘永明苏何玲蒋林彬纪冬刘文思兰兰徐东平钟彦伟
- 关键词：拉米夫定药物耐受性
