康健
- 作品数：7 被引量：16H指数：3
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家科技重大专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 哺乳动物配子冷冻保存并应用于珍稀濒危动物保护的技术策略被引量：3
- 2022年
- 配子(精子和卵子)冷冻保存是将配子在超低温条件下冷冻,可进行优秀家畜个体和珍稀濒危动物种质资源的长期保存。配子冷冻是珍稀濒危动物种质资源保护、保存和利用的一项重要内容,也是动物种质资源库建设的一项关键技术。本文对国内外精子和卵母细胞冷冻保存利用技术的研究现状进行了详细论述,同时介绍了配子冷冻-解冻后的损伤评估研究,提出了未来我国在濒危珍稀动物配子冷冻保存方面的应用策略和保种建议,以期为我国家畜生物种质资源库建设、家畜种质资源保护和开发利用以及珍稀濒危动物保护提供参考。
- 高峰何琪富吴盛辉王少文徐雪瑞康健张涌张涌
- 关键词：卵子冷冻
- CRISPR/Cas9介导的Myostatin基因定点突变秦川牛的生产
- 肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)又称生长分化因子8(growth differentiation factor8,GDF-8),属于转化生长因子β(transforming growth factor β,...
- 康健葛陆星王勇胜权富生张涌
- 关键词：MYOSTATIN基因定点突变
- 山羊Zfy基因克隆分析及其敲除载体构建被引量：2
- 2022年
- 旨在对西农萨能奶山羊Zfy基因进行克隆和生物信息学分析,并利用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除Zfy基因的奶山羊成纤维细胞株,为进一步探索Zfy基因功能及性别调控提供基础数据。本研究以健康的西农萨能奶山羊为对象,采集3只3月龄公山羊睾丸组织并提取总RNA。根据NCBI中预测的山羊Zfy基因mRNA序列信息(GenBank登录号:XM_018044893)设计引物,利用RT-PCR技术分段克隆获得山羊Zfy基因序列,使用相关生物信息学软件分析Zfy基因CDS区核苷酸序列并预测其蛋白质的结构和功能。针对山羊Zfy基因CDS区共设计了4条sgRNA,构建4个打靶载体并转染山羊胎儿成纤维细胞(GFFs),利用T7E1酶切检验打靶载体的切割效率,通过嘌呤霉素筛选敲除Zfy基因的GFFs阳性单克隆细胞,经PCR扩增、测序检测突变率。结果显示,成功克隆得到了长度为2406 bp的西农萨能奶山羊Zfy基因CDS区序列。同源性以及系统进化树分析表明,山羊Zfy基因序列与马鹿、牛、绵羊的同源性高,亲缘关系较近,与小鼠的同源性最低,亲缘关系最远。生物信息学软件分析显示,山羊Zfy基因共编码801个氨基酸,分子质量为90.37 ku,Zfy蛋白含66个磷酸化位点,等电点为5.66,亲水性较高,无信号肽,是一个结构不稳定的非分泌蛋白。T7E1酶切发现,4个打靶载体均可发挥敲除活性,切割效率分别为12.31%、40.86%、31.52%、26.37%。选择切割效率最高的打靶质粒转染山羊胎儿成纤维细胞(GFFs),经嘌呤霉素筛选获得能稳定靶向敲除Zfy基因的GFFs阳性细胞株,PCR测序检测突变率为23.91%。综上所述,本研究成功克隆了西农萨能奶山羊Zfy基因并揭示了该基因所编码蛋白的理化性质;成功构建了山羊Zfy基因CRISPR/Cas9敲除载体,并筛选出最佳敲除位点,获得了Zfy基因敲除的亚克隆细胞,为深入研究山羊Zfy基因功能及开发性别控制技术奠定了基础。
- 黄敏谢晓刚何琪富曹旭阳董翔宸康健刘军权富生
- 关键词：西农萨能奶山羊生物信息学分析基因敲除
- 一种通用型piggyBac转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证被引量：5
- 2014年
- 为了构建一种高效、通用的细胞永生化载体pTP-hTERT,通过人工合成、PCR、酶切连接等方法,对传统piggyBac(PB)转座子系统进行改造。改造后的载体含有转座必需元件、PB转座酶(PBase)表达框、共表达筛选元件和人端粒逆转录酶(hTERT)基因表达框。其中筛选元件中绿色荧光蛋白(EGFP)基因和嘌呤霉素抗性(Puror)基因以猪捷申病毒2A自我剪切肽相连,以实现共表达。为验证载体元件功能,使用该载体转染HEK 293细胞,并对筛选出的阳性细胞进行RT-PCR、Western blotting(WB)、热不对称PCR(Tail-PCR)和细胞克隆亚甲蓝染色与统计分析。载体测序鉴定与细胞培养结果表明,通用型永生化载体pTP-hTERT构建成功,转染HEK293细胞后能筛选出抗嘌呤霉素细胞单克隆;WB结果显示P2A可高效切割EGFP和Puror融合蛋白,证明筛选标记基因功能正常;Tail-PCR结果表明该载体以转座整合插入宿主基因组;亚甲蓝染色统计结果显示由pTP-hTERT引发的细胞阳性克隆数与对照组相比显著提高(P<0.01)。PB转座子永生化载体pTP-hTERT的构建为永生化细胞系的建立提供了工具,同时也为其他真核载体的构建和改造提供了参考。
- 黄惠胡广东康健卿素珠张涌
- 关键词：HTERT
- 性控奶山羊精液X和Y精子分离比例检测方法的建立被引量：2
- 2021年
- 旨在建立可以定量计算奶山羊精液中X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法,用以检测经过分离的奶山羊精液X和Y精子的数量和比例,为性控技术的开发和生产应用提供技术支撑。本研究选择X、Y染色体中特异基因F9及ZFY片段设计引物,建立标准曲线,优化荧光定量PCR反应体系和条件。通过对阳性标准品梯度稀释以及对60支已知纯度的性控精液进行测定(3次重复)来检验方法的敏感性和可靠性。结果显示,所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,X和Y精子检测灵敏性分别为47和51 copies·μL~(-1);利用该方法对商品化的奶山羊性控冷冻精液中X和Y精子的数量和比例进行计算,其结果与销售公司提供的X和Y精子的纯度无显著差异(P>0.05),表明该方法结果可靠。本研究建立的计算奶山羊X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,灵敏度高,结果可靠,为计算奶山羊精液分离后X、Y精子数量及比例提供了快速可靠的方法。
- 何琪富王宇飞张康康健张涌张涌
- 关键词：实时荧光定量PCR性别控制奶山羊
