周佳维
- 作品数：11 被引量：15H指数：3
- 供职机构：浙江大学医学院附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市教育委员会创新基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 凝血因子ⅨArg327Ile突变蛋白结构与功能研究
- ＜正＞目的:探讨F9基因Arg327Ile（R327I）突变导致血友病B的分子发病机制研究。方法:定点突变法构建F9基因R327I突变的表达质粒。瞬时转染HEK293细胞,一期法检测细胞上清液中凝血因子Ⅸ活性（FⅨ:C）...
- 周佳维戴菁郁婷婷陆晔玲丁秋兰王学锋王鸿利
- 文献传递
- 2种F10基因新突变导致凝血因子Ⅹ缺陷症的分子发病机制研究被引量：3
- 2010年
- 目的:探讨1个凝血因子Ⅹ(FⅩ)缺陷症家系的分子发病机制。方法:对先证者及家系成员凝血、抗凝及纤溶功能筛查以及凝血因子活性及抗原含量检测进行表型诊断;以Western Blotting检测血浆中FⅩ抗原含量和分子量大小;以中和试验检测FⅩ的抑制物。以PCR方法对F10基因所有外显子及侧翼序列和5’端非翻译区进行扩增,产物纯化后直接测序进行基因诊断;构建F10基因突变表达质粒,瞬时转染HEK293T细胞,测定表达产物的FⅩ促凝活性(FⅩ:C)和FⅩ抗原含量(FⅩ:Ag)。结果:先证者FⅩ:C和FⅩ:Ag分别为<1%和53.36%,中和试验结果阴性,诊断为交叉反应物质阳性(CRM+)的FⅩ缺陷症。F10基因分析发现2个杂合突变:IVS5+1G>A和Asp368del。Asp368del体外表达显示FⅩ:C和FⅩ:Ag分别为(0.52±0.04)%和(85.9±5.0)%,为CRM+突变。结论:F10基因双重杂合突变IVS5+1G>A和Asp368del导致该家系遗传性FⅩ缺陷症。剪接位点突变IVS5+1G>A导致内含子无法正常剪接,影响FⅩ正常表达。Asp368del突变蛋白能够正常表达,但功能降低。
- 周佳维陈琼丁秋兰王学锋奚晓东王鸿利
- 关键词：基因突变分子机制
- 医院相关性ST5型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ZJ5499的全基因测序及序列分析被引量：3
- 2016年
- 目的对1例医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)肺炎患者血中分离的1株MRSA(ZJ5499)进行基因组序列信息解析。方法采用Illumina平台高通量测序和Sanger测序相结合对ZJ5499菌株进行全基因组测序,并使用相关软件对序列进行拼接、基因预测、功能注释、直系同源簇注释(COG)及毒力因子和耐药基因分析;并与国内常见流行序列型(ST型)菌株进行进化关系分析、毒力因子和耐药基因比较。结果 ZJ5499菌株基因组大小为2 888 783bp,GC含量32.84%,序列已提交至GenBank数据库,登录号为CP011685。该菌株基因组中含有大量与致病性相关的毒力因子,并含有spc、aadD、mecA、norA和erm(A)五个耐药相关基因,与同一ST型菌株基本一致。进化关系分析显示该菌株与同一ST型菌株关系较近。毒力因子与ST5型菌株没有较大差异,而较其他ST型明显增多。结论本研究报道了临床MRSA菌株ZJ5499的全基因组序列。序列分析发现该菌株的毒力和耐药性与ST5型的菌株相近,而ST5型菌株较其他国内流行ST型菌株携带较多毒力基因。
- 周佳维李昂蒋琰华孝挺俞云松
- 关键词：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌全基因组测序毒力因子耐药基因
- 凝血酶生成试验在遗传性凝血因子缺陷症患者出血评估中的价值
- 黄丹丹王鸿利陆晔玲戴菁董雷鸣陈琼周佳维丁秋兰奚晓东王学锋
- F9基因Arg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制研究被引量：1
- 2011年
- 目的探讨F9基因Arg327Ile(R327I)突变导致血友病B的分子发病机制研究。方法对1名血友病B患者作实验室和基因诊断,定点突变法构建F9基因R327I突变的表达质粒;瞬时转染HEK293细胞,一期法检测细胞上清液中凝血因子Ⅸ活性(FⅨ∶C),ELISA法检测细胞上清液和裂解中FⅨ抗原(FⅨ∶Ag),Western blotting检测R327I突变蛋白的分子量及表达量;免疫荧光共定位染色法检测突变蛋白在内质网和高尔基体内分布。结果瞬时表达显示该患者突变细胞标本上清液中R327I突变型FⅨ∶C为野生型的4.49%,明显降低;细胞上清液和裂解液FⅨ∶Ag分别为野生型的31%和129%,为交叉反应物质减低型(CRMR)。Western blotting显示细胞上清液中R327I突变蛋白分子量与野生型相同,但含量比野生型明显降低;免疫荧光共定位染色显示R327I突变蛋白在内质网中分布较野生型多,而在高尔基体中较野生型少。结论 F9基因R327I突变影响蛋白质合成和分泌,突变蛋白较野生型表达量偏低,同时R327I突变蛋白存在凝血功能缺陷从而导致血友病B。
- 周佳维戴菁郁婷婷陆晔玲丁秋兰王学锋王鸿利
- 关键词：血友病B基因突变发病机制
- 凝血因子Ⅸ Arg327Ile突变蛋白功能缺陷机制研究
- 2011年
- 目的研究FⅨ Arg327Ile（R327I）及Arg327Ala（R327A）突变蛋白功能，探讨R327I突变导致血友病B的分子发病机制。方法采用潮霉素筛选稳定表达细胞株，ELISA法筛选高效表达FIX重组蛋白细胞株，采用快流速Q琼脂糖凝胶和离子交换两步法分离纯化重组蛋白。ELISA和SDS—PAGE电泳分别检测重组蛋白含量和纯度。FⅦa／TF／Ca“和FⅨa／Ca^2＋活化野生型及R327I和R327A突变FⅨ蛋白，用WB法分别检测不同时间内活化生成的FⅨa。野生型及两种突变FIXa在不同FⅧa浓度下活化激活FX，以此计算野生型及两种突变FⅨa与FⅧa的解离常数；在含或不含FⅧa的条件下，检测野生型及两种突变FⅨa对不同浓度FX的激活能力，以此计算其催化效率。结果表达分离纯化野生型、R327I和R327A FⅨ重组蛋白总量分别为450、210和64μg，SDS—PAGE电泳结果显示重组蛋白纯度符合要求。两种突变蛋白均能被FⅦa／TF／Ca^2＋和FⅪa／Ca^2＋正常激活。R3271与R327A两种FIXa突变蛋白与FⅧa的结合力分别为野生型的1／4和1／5。在含FⅧa条件下，R327I和R327I突变FⅨa对FX催化效率分别为野生型的1／6和1／8。而不含FⅧa条件下，催化效率分别为野生型的1／3和1／7．4。结论R327I和R327A两种突变FⅨa与FⅧa结合异常，R327位点参与FⅧa结合，同时也与底物活化相关。R327I突变与FⅧa结合力降低导致重型血友病B的发生.
- 周佳维戴菁郁婷婷陆晔玲丁秋兰王学锋王鸿利
- 关键词：重组蛋白质类突变血友病B
- 体外表达探讨凝血因子IXArg327Ile新突变导致血友病B的分子发病机制
- 2012年
- 目的探讨凝血因子Ⅸ（FIX）Arg327Ile（R327I）突变导致血友病B的分子发病机制。方法在野生型FIX表达质粒FIX”peDNA3．1（一）的基础上，定点突变法构建FIXR327I、R327Ala（A）、R327Lys（K）和R327Asn（N）突变的表达质粒，重叠PCR构建FIX324～329（B折叠结构域）换成FVIl298～303同源结构突变表达质粒[FⅨBFVIIpeDNA3．1（一）]。将野生型及各种突变体表达质粒分别瞬时转染胚肾293T细胞，一期法检测培养上清液中FIX活性（FIX：C）及ELISA法检测细胞培养上清和细胞裂解液中FⅨ抗原（FⅨ：Ag），Westernblot法检测突变蛋白的相对分子质量及表达水平。荧光蛋白表达载体瞬时转染法检测活细胞中突变蛋白合成与分泌。结果体外瞬时转染FIXR327I突变基因的细胞FIX：C为正常野生型的4．49％，细胞上清液和细胞裂解液FIX：Ag水平分别为野生型的31．02％和129．29％，为交叉反应减低型（CRMR）。活细胞免疫荧光观察发现FIXR327I突变蛋白在细胞内含量较野生型显著增高，并且在细胞溶酶体内的含量较野生型也显著增多。FIXR327A、R327K、R327N及FIXl3FVII突变基因转染的细胞FIX：c水平较野生型减低，其中以FIXl3FVII突变降低最为明显；转染的细胞培养上清FIX：Ag水平除R327K突变型较野生型增加，其余突变型均比野生型有不同程度的降低。Westernblot法检测显示各种突变蛋白的相对分子质量与野生型相同而表达水平降低。结论FIXR327I突变基因可影响蛋白质合成和分泌，R327位点与FⅨ功能特异有关，其所在的B折叠结构域在FⅨ特异性功能中发挥重要作用。
- 周佳维王鸿利戴菁郁婷婷陆晔玲丁秋兰王学锋
- 关键词：血友病B凝血因子IX基因突变
- 社区获得性ST59型MRSA HZW450的全基因组测序及分析被引量：1
- 2017年
- 目的对1例脓疱疮患者脓液中分离的1株社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)HZW450菌株进行全基因组测序并对序列信息解析。方法使用三代测序PacBio技术对HZW450菌株进行全基因组测序,且使用SMRTanalysis v.R2.3.0对该序列进行序列拼接,上传NCBI进行基因功能注释,用RPSBLAST program进行直系同源簇(COG)注释以及毒力因子相关基因和耐药基因分析。同时比较国内其他地区发现的同一序列型(ST)的菌株毒力因子相关基因及耐药相关基因的差异,并比较HZW450菌株耐药基因型与表型的一致性。结果 HZW450菌株的基因组大小为2 831 958bp,GC占比32.9%,其基因组完成图序列已提交至NCBI GenBank数据库,登录号为CP020741。同时经过分析发现该菌株为ST59型,其基因组中含有许多与致病相关的毒力因子,以及含有耐药基因aph(3′)-III、ant(6)-Ia、mecA、norA、erm(B)和cat(pC233),毒力及耐药基因与ST59型其他菌株比较有差异。该菌株临床药敏结果与耐药基因比较分析发现,耐药表型与基因型存在差异。结论本研究报道了1株CA-MRSA(HZW450)菌株的全基因组序列。基因序列分析显示该菌株携带大量毒力基因,包括lukS-PV、lukF-PV、eta、fnbA、fnbB、sspB、sspC等,编码毒素、粘附、免疫逃逸等相关毒力因子,其毒力较强,致病性较高。
- 倪淑君郭丽华周佳维孟晓华姚坚吴灵娇张琼李兰娟
- 关键词：社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌全基因组分析耐药基因型
- 凝血酶生成试验在遗传性凝血因子缺陷症患者出血评估中的价值被引量：4
- 2011年
- 目的探讨遗传性凝血因子V(FV)、X(FX)和XI(FXI)缺陷及FV和凝血因子VⅢ(FVⅢ)联合缺陷(F5F8D)患者的血浆凝血因子活性、凝血酶生成曲线各参数和临床出血症状之间的关系。方法采集遗传性FV(n=24)、FX(n=14)和FXI(n=18)缺陷及F5F8D(n=8)患者及携带者的外周血进行常规出凝血检查及自动校正凝血酶曲线法凝血酶生成试验。结果凝血酶生成曲线的各项参数与FV促凝活性(FV:C)及FX促凝活性(FX:C)存在双曲线趋势关系。FV或FX缺陷患者血浆中缺陷因子的活性只要达到正常人的3%,凝血酶生成潜力和峰值就达到正常值的一半以上。FV:C≤6.9%或FX:C≤2.2%的患者具有出血症状,活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、延迟时间及达峰时间都有不同程度的延长。具有重度出血症状的3例患者的缺陷因子(FV或FX)活性均≤1.5%,APTT、PT、延迟时间和达峰时间都明显延长,且ETP=0。结论凝血酶生成试验的各项参数与凝血因子FV、FX活性及出血症状的发生及严重程度具有相关性,凝血酶生成试验结合APTT、PT及凝血因子活性可以作为评估遗传性凝血因子缺陷症患者出血倾向的有效手段。
- 黄丹丹陆晔玲戴菁董雷鸣陈琼周佳维丁秋兰奚晓东王学锋王鸿利
- 关键词：凝血酶生成出血
- 遗传性凝血因子X缺陷症三例及其分子发病机制研究被引量：3
- 2010年
- 目的 对3个遗传性FX缺陷症家系进行临床表型和基因型研究,并探讨其分子发病机制.方法 对3例先证者进行止凝血筛查,检测APTT和PT 利用凝固法和ELISA检测FX∶C和FX∶Ag.采用交叉纠正试验排除血浆中FX抑制物的存在,采用凝血酶生成试验检测3例先证者及健康对照者血浆中凝血酶的生成.采用蛋白印迹半定量方法检测血浆中FX抗原浓度和相对分子质量大小.对FX基因采用直接测序进行基因诊断.构建突变型表达质粒,瞬时转染293T细胞,分别测定转染细胞裂解液及培养上清液中FX∶Ag,测定上清液中FX∶C,实验重复3次.结果 先证者1的APTT和PT均明显延长,分别为113.4 s和62.3 s,交叉纠正试验被纠正,血浆中几乎没有凝血酶的生成.先证者2的APTT和PT分别为56.5 s和28.7 s,交叉纠正试验也被纠正,血浆中凝血酶生成为1 101.5 nmol·min.先证者3的APTT和PT分别为117.3 s和44.3 s,交叉纠正试验被纠正,凝血酶生成为782.5 nmol·min.先证者1的FX∶C和FX∶Ag分别为1.4%和3.6%,基因诊断结果显示,FX基因存在纯合突变Ser425→Pro,该突变体外表达显示能够在细胞中正常合成,但分泌障碍 先证者2的FX∶C和FX∶Ag分别为2.2%和5.5%,FX基因存在双杂合突变Ala-29→Pro和Phe324→Leu,Ala-29→Pro突变导致FX表达量在细胞裂解液和培养上清液中均明显减少,分别为野生型质粒的（41.32±5.21）%和（6.30±1.84）%,而Phe324→Leu突变在细胞中几乎不影响FX的合成 先证者3的FX∶C和FX∶Ag分别为2.2%和35%,FX基因存在双杂合突变Ala235→Thr和Arg347→Cys,这2种突变使FX在细胞裂解液中与野生型蛋白表达量相似,而细胞上清液中较野生型蛋白明显减低,分别为野生型的（23.03±1.92）%和（42.51±2.07）%.结论 本研究发现了5种新的FX基因突变 其中Ser425Pro、Phe324Leu、Ala235 Thr和Arg347Cys突变不影响FX突变蛋白的合成,而Ala-29Pro突变则导致FX突变蛋白合成减少,伴分泌障�
- 陈琼周佳维丁秋兰王学锋戴菁黄丹丹陆晔玲许冠群张利伟奚晓东王鸿利
- 关键词：因子X突变系谱
