陈可
- 作品数：8 被引量：15H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院感染性疾病分子生物学教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市教育委员会科学技术研究项目重庆市教委科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 通过自诱导方法对乙型肝炎病毒聚合酶TP区进行可溶性表达及鉴定被引量：5
- 2017年
- 目的构建包含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)聚合酶TP区段的重组原核表达质粒,转化表达型大肠埃希菌,以自诱导培养方法获得可溶性表达,并对其进行鉴定。方法分析HBV(A型)聚合酶N-末端1-192 AA区域的DNA序列,通过网络工具(http://www.jcat.de/)在线优化,并在5′和3′端分别添加NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点后,送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行人工合成;将人工合成的TP-DNA双酶切后,插入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS进行自诱导表达。结果重组原核表达质粒pET32a(+)/POL-TP-Opt经双酶切及测序证明构建正确;在表达菌的破菌上清中有特异性表达的蛋白,相对分子质量约20 000,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,为可溶性的重组TP蛋白。结论通过自诱导培养方法,直接成功获得可溶性的重组TP蛋白,改变了长期以来依靠包涵体复性对TP蛋白相关功能进行研究的状况。
- 陈可代娟甘春扬刘亚罗英英胡接力蔡雪飞
- 关键词：乙型肝炎病毒聚合酶原核细胞基因表达
- 丙型肝炎病毒P7蛋白体外原核表达状况的研究被引量：1
- 2011年
- 目的:扩增丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus,HCV)P7蛋白基因,克隆到多个原核表达系统,观察P7蛋白在体外表达的情况,获取具有生物学活性的HCVP7重组蛋白。方法:设计扩增全长HCVP7基因片段的特异引物,以H/FL质粒DNA(含HCV1acDNA全长序列)为模板,通过PCR扩增全长HCV P7基因,定向克隆到pQE30、pGEX 4T-2、pET32a(+)3种不同类型的原核表达载体中。将重组后包含HCVP7基因的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或SG13009(PREP4),并做异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定HCV P7蛋白原核表达的情况。结论:获得可溶性的重组蛋白GST-HCVP7和Trx-HCVP7,为进一步研究P7蛋白的生物学功能奠定基础。
- 陈可胡接力胡源张文露王增产汤华黄爱龙蔡雪飞
- 关键词：丙型肝炎病毒原核表达
- pcDNA3.1载体对内参基因表达影响分析被引量：2
- 2010年
- 目的:研究转染质粒pcDNA3.1对内参基因表达影响差别,为今后在采用pcDNA3.1载体进行表达分析时内参基因的选择提供参考。方法:选用HepG2、HEK293、Hela、A549、QGY共5种细胞转染pcDNA3.1空载体质粒,转染后48h提取细胞总RNA荧光定量PCR法比较内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphste dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)、18sRNA表达水平差异,提取细胞总蛋白,检测GAPDH、β-actin表达水平差异。结果:5种细胞在转染质粒pcDNA3.1后,内参基因转录和蛋白表达均出现不同程度的下降,其中以β-actin下降最为明显,GAPDH及18sRNA在转录水平下降幅度小,且下降程度接近。结论:pcDNA3.1质粒转染造成基因表达非特异性抑制,其中对管家基因β-actin影响较大,因此在应用pcDNA3.1来源载体进行基因功能分析时,不推荐使用β-actin作为内参基因。
- 陈可王增产
- 关键词：PCDNA3.1内参基因转染转录
- 结构特异性核酸酶FEN1对HBV复制的影响被引量：2
- 2012年
- 目的探索宿主因子FEN1对HBV复制过程的影响。方法构建FEN1过表达慢病毒质粒,酶切鉴定并测序,转染293FT细胞,Western blot检测FEN1蛋白表达。将该质粒转染HBV复制稳定细胞系,设立慢病毒包装改造质粒pLenti6/V5-D-TOPO和不转染质粒的细胞作为对照。ELISA检测细胞上清,Southern blot及Real-time PCR检测HBV DNA。结果初筛阳性克隆提取质粒酶切鉴定,于FEN1及线性载体质粒大小处出现明亮单一条带,测序结果表明序列插入正确,Western blot检测FEN1蛋白表达量为对照的2～3倍。FEN1过表达质粒转染HBV复制稳定细胞株,细胞上清ELISA检测HBsAg抗原呈阳性,D(450)值为(1.982±0.032);细胞内提取病毒DNA行Real-time PCR,绝对定量拷贝数为1.18×109,Southern blot检测亦表明HBV复制水平明显上调。结论结构特异性核酸酶FEN1能够明显促进HBV DNA复制,是体内一种重要的病毒复制调控因子。
- 潘万龙方岩许舸单雪峰徐蕾陈可黄爱龙胡接力
- 关键词：慢病毒载体乙型肝炎病毒病毒复制
- 利用绿色荧光蛋白进行microRNAs靶点分析的研究被引量：1
- 2012年
- 目的利用绿色荧光蛋白作为报告基因,研究微RNAs(microRNAs)与靶点相互作用。方法在pEGFP-C1下游非编码区插入含miR-122a作用靶序列HCV 5′UTR,构建pEGFP-UTR载体,将miR-122a与pEGFP-UTR共转染HEK293细胞,观察增强绿色荧光蛋白EGFP表达强度变化,并与双荧光素酶报告系统比对。结果 miR-122a能明显抑制含UTR靶序列的EGFP蛋白表达,与双荧光素酶报告系统相比,绿色荧光蛋白在检测灵敏度上与双荧光素酶相接近。结论利用绿色荧光蛋白作为报告基因,能够清楚直观反映miRNAs与靶点作用情况。
- 陈可刘湘
- 关键词：微RNAS靶点报告基因
- 肺炎链球菌表面蛋白C诱导人嗜中性粒细胞分泌IL-8的机制研究被引量：1
- 2012年
- 目的研究肺炎链球菌表面暴露的毒性表面蛋白C(PspC)促进IL-8分泌的可能机制。方法使用炎症相关的信号分子NF-κB,p38MARK,ERK,JNK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,观察PspC对IL-8分泌的影响。从受PspC刺激的人嗜中性粒细胞中分别提取细胞总蛋白和细胞核提取物,用ELISA法测定p38MAPK蛋白的活力和NF-κB的浓度,并且采用Western blot方法验证PspC对p38MAPK和IκB-α蛋白磷酸化水平的影响。结果使用NF-κB及p38MARK的抑制剂预处理人嗜中性粒细胞后,可以扭转PspC促中性粒细胞分泌IL-8的现象;而ERK和JNK的抑制剂无此效果。同时,PspC可以上调中性粒细胞中的P38MAPK蛋白的含量和NF-κB的浓度,也可以提高p38MAPK和NF-κB通路的抑制蛋白IκB-α蛋白磷酸化水平。结论肺炎链球菌PspC诱导人体中性粒细胞释放IL-8受p38MAPK和NF-κB途径的调控。
- 陈可陈丹曹炬徐蕾
- 关键词：肺炎链球菌中性粒细胞IL-8NF-ΚB
- SIRT1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖的影响被引量：1
- 2013年
- 目的:探讨慢病毒介导沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)基因的shRNA对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法:设计、合成2对针对SIRT1基因shRNA的寡核苷酸序列,与pLentilox3.7-GFP载体连接产生重组慢病毒质粒pshSIRT1-1、pshSIRT1-2,同时构建不针对任何基因的shRNA阴性对照pshCont。将表达shRNA的载体plentilox3.7与pLP1、pLP2和pLP/VSVG 3种质粒共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒感染人乳腺癌细胞MCF-7,行real time-PCR和Western blot验证SIRT1基因的沉默效果,台盼蓝排斥实验和流式细胞仪分别检测其对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。结果:成功构建靶向SIRT1基因shRNA慢病毒载体并获得了相应的慢病毒。2个靶向SIRT1的shRNA均能有效抑制SIRT1基因的表达(P=0.000 2),并使MCF-7细胞增殖明显减慢,凋亡明显增加(P=0.006 0)。结论:靶向SIRT1基因RNA干扰能显著抑制MCF-7细胞的生长并促进其凋亡。
- 陶颖陈可宋春丽任吉华陈娟
- 关键词：慢病毒乳腺癌细胞RNA干扰
- 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对乙型肝炎病毒复制的影响被引量：2
- 2014年
- 目的:研究SIRT1抑制剂sirtinol、曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响,并探讨组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)在HBV复制过程中的作用。方法:运用MTS分析HepG2.2.15细胞对sirtinol、TSA的耐受程度;real-time PCR和Southern blot验证sirtinol和TSA对HepG2.2.15细胞中HBV复制中间体表达的影响;Western blot和ELISA分析sirtinol对HBV核心蛋白(HBc)和HBsAg、HBeAg表达的影响。结果:sirtinol能抑制HBV复制中间体、HBc的表达和HBsAg、HBeAg的分泌,TSA可以促进HBV的复制。结论:SIRT1抑制剂sirtinol具有抗病毒作用。
- 陈可任吉华宋春丽冉龙宽李宛蔚陈娟
- 关键词：SIRT1乙肝病毒复制曲古抑菌素A
