董姗姗
- 作品数：7 被引量：21H指数：3
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市自然科学基金重庆市教育委员会科学技术研究项目更多>>
- 相关领域：医药卫生电子电信更多>>
- 肺炎链球菌溶血素的体外表达及活性鉴定被引量：7
- 2011年
- 目的体外扩增肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)的溶血素(pneumolysin,ply)基因,在大肠杆菌中高效表达,并验证其生物活性。方法分离培养D39型肺炎链球菌并提取其基因组DNA,采用PCR技术体外扩增ply基因,体外重组将ply序列克隆到原核表达载体pET28(a)内,测序鉴定后将重组子转化到E.coliRosetta(DE3)中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的Ply重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后检测其溶血活性和细胞毒性。结果克隆的ply序列与GenBank中的数据相符,并实现了Ply蛋白的可溶表达。所获重组蛋白纯度达到95%。溶血实验显示Ply对人红细胞具有极高的溶血活性,与对照组相比较差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖。细胞毒实验显示Ply对脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)细胞具有明显抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量与时间依赖性,IC50(24h)为1.525μg/ml。结论经测序鉴定ply基因正确扩增,并成功表达、纯化出具有高溶血活性和细胞毒性的Ply蛋白。
- 贺潇袁军王虹李忱炜姜慧董杰崔瑾董姗姗周爱娥张雪梅胥文春尹一兵何於娟
- 关键词：肺炎链球菌溶血素原核表达
- 肺炎链球菌溶血素诱导THP-1细胞凋亡涉及MAPK1/3信号途径
- 2011年
- 目的探讨肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,Ply)对人急性单核细胞白血病单核细胞株THP-1细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及机制。方法 MTT法检测Ply对THP-1细胞的增殖抑制。瑞氏染色观察Ply对人THP-1细胞形态的影响。AnnexinV-FITC/PI双标法检测细胞凋亡。琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA片段化现象。免疫组化和Western blot检测MAPK1/3蛋白表达的变化。结果将人THP-1细胞分别与0.05、0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml Ply共同孵育后,在24、48、72、96 h用MTT法检测细胞增殖抑制率,发现Ply对人THP-1细胞具有明显的增殖抑制作用,并且呈剂量和时间依赖性,IC50(24 h)为1.31μg/ml;0.05μg/ml和0.1μg/ml Ply分别处理THP-1细胞12 h后,通过瑞氏染色法观察人THP-1细胞可见凋亡小体及核碎裂象等典型的凋亡形态学改变;用0.05μg/ml Ply和0.1μg/ml Ply作用THP-1细胞12 h后细胞早期凋亡率分别为11.83%和48.45%(P<0.05);提取凋亡THP-1细胞DNA,进行琼脂糖凝胶电泳可见典型的"梯状"条带;Ply作用于人THP-1细胞后,胞内MAPK1/3蛋白表达降低(P<0.05)。结论 Ply可诱导人THP-1细胞凋亡,此作用涉及MAPK1/3信号通路的参与。
- 姜慧贺潇袁军王虹李忱炜董杰崔瑾董姗姗周爱娥张雪梅胥文春尹一兵何於娟
- 关键词：肺炎链球菌溶血素THP-1细胞凋亡
- 肺炎链球菌dnaJ基因缺陷菌株的构建及毒力变化的初步研究被引量：5
- 2011年
- 目的构建肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)dnaJ基因缺陷菌株,并对其毒力作初步研究。方法采用长臂同源多聚酶链式反应(long flanking homology polymerase chain reaction,LFH-PCR)技术将dnaJ基因替换为红霉素耐药基因(erm)后同源重组于肺炎链球菌,在含红霉素的血平板上筛选出dnaJ缺陷菌株。用PCR鉴定缺陷菌株,以细菌的吸光度值D(600 nm)观察体外缺陷菌株生长情况。将44只BALB/c小鼠采用随机数字表法分为2组,分别用野生菌株和缺陷菌株处理,腹腔攻毒100μl高(2×108cfu)、低(2×106cfu)剂量的菌液,各处理组的不同剂量组均有11只小鼠。记录小鼠死亡时间,计算存活率。60只BALB/c小鼠采用随机数字表分为2组,分别鼻腔滴注含菌量为2×107 cfu的30μl D39菌液和△dnaJ菌液,感染后6、12、24、36、48 h处死每组中的5只小鼠,分别取鼻咽灌洗液、肺组织(匀浆)和心脏血培养,根据每组平均菌落计数结果绘制细菌在宿主体内的定植曲线。结果 PCR结果显示dnaJ基因完全被erm基因所替代,构建dnaJ缺陷菌成功;单个菌落培养基生长情况表明体外热休克状态抑制dnaJ缺陷菌生长;小鼠毒力实验显示腹腔感染缺陷菌株的小鼠存活率可达到100%,而感染野生菌株的小鼠全部死亡,两者比较有统计学差异(P<0.01)。小鼠鼻腔感染模型中,缺陷菌株在各时间点鼻咽灌洗液和肺部的细菌载量均显著低于野生菌株,而且入血后可在感染24 h内被宿主清除,上述差异有统计学意义(P<0.01)。结论采用LFH-PCR技术作基因突变完全替代dnaJ基因,方法简便快捷;dnaJ的缺陷影响细菌在体外应激条件下的生长,并显著降低细菌在宿主体内的毒力和定植。
- 崔瑾张群董杰姜慧周爱娥董姗姗张雪梅尹一兵王虹
- 关键词：肺炎链球菌DNAJ毒力
- 肺炎链球菌假想蛋白SPD0414亚细胞定位及对细菌黏附侵袭的影响
- 2011年
- 目的 为研究肺炎链球菌假想蛋白SPD0414在肺炎链球菌（S.pn）的亚细胞定位,并初步研究其在S.pn黏附和定植中的作用.方法 通过分别在SPD0414的N端和C端融合绿色荧光蛋白（GFP）,共聚焦荧光显微镜观察定位情况.用203野生菌和203△spd0414缺陷菌对鼻咽癌细胞CNE和肺腺癌细胞A549细胞的黏附侵袭实验.体内实验中用203和203△spd0414滴鼻感染BALB/c,在6 h和12 h观察细菌在鼻腔和肺中的载量.结果 无论N端或C端融合的GFP都显示绿色荧光,且整个菌体都显示荧光.与203野生菌相比,203△spd0414缺陷菌对CNE和A549的黏附和侵袭能力均显著下降（P＜0.05）.滴鼻感染BALB/c小鼠,在6 h和12 h,203△spd0414在鼻腔和肺中的细菌载量也明显低于203野生菌（P＜0.05）.结论 肺炎链球菌假想蛋白SPD0414定位于细菌的胞质.该蛋白在细菌的定植和侵袭中发挥了重要的作用.
- 董杰周爱娥崔瑾董姗姗姜慧张雪梅尹一兵王虹
- 关键词：肺炎链球菌GFP融合蛋白亚细胞定位
- 肺炎链球菌dnaJ基因缺陷对小鼠肺炎感染模型天然免疫应答的影响被引量：3
- 2013年
- 目的探讨肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)dnaJ基因缺陷对肺炎感染模型小鼠天然免疫应答的影响。方法将BALB/c小鼠随机分为空白对照组、D39感染组和△dnaJ感染组,分别经鼻腔滴注30μl无菌PBS、30μl含2×107cfu的S.pn D39和△dnaJ(dnaJ基因缺陷株)菌液,复制小鼠肺炎感染模型。于感染后6、12、24、36和48 h处死小鼠,取肺组织,匀浆后分离上清,ELISA检测促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFNγ的表达水平,HE染色观察感染12 h的小鼠肺组织炎症反应变化;将小鼠巨噬细胞株RAW264.7体外感染S.pn D39和△dnaJ,细菌与细胞的比例为100∶1,感染1、2、3 h后分离细胞培养上清液,ELISA检测TNF-α和IL-6的表达水平。实时定量PCR和Western blot分别检测感染12 h的小鼠肺组织中模式识别受体TLRs基因mRNA的转录水平和炎症相关信号p38MAPK的磷酸化水平。结果与D39感染组相比,△dnaJ感染组小鼠肺组织炎症反应强度下降,TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子水平达峰时间延迟,且峰值降低,RAW264.7细胞感染3 h分泌TNF-α和IL-6显著减少(P<0.01或P<0.05);小鼠肺组织Tlr2和Tlr13基因mRNA转录水平显著降低(P<0.05),p38MAPK的磷酸化水平也明显下降。结论肺炎链球菌dnaJ基因缺陷可下调肺炎感染模型小鼠的炎症反应、促炎因子分泌及胞内信号分子的激活,也可影响小鼠感染后肺组织中Trl2和Tlr13基因mRNA的表达,为进一步研究机体对肺炎链球菌DnaJ蛋白的天然免疫应答分子机制奠定了基础。
- 崔瑾董杰姜慧周爱娥董姗姗张雪梅尹一兵王虹
- 关键词：肺炎链球菌DNAJTLRS
- 肺炎链球菌溶血素经死亡受体/Fas途径和线粒体途径诱导RAW264.7细胞凋亡被引量：3
- 2012年
- 目的:探讨肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,Ply)对小鼠RAW264.7细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用及机制。方法:Ply蛋白加入RAW264.7细胞培养上清与细胞共孵育。倒置显微镜观察Ply对RAW264.7细胞形态的影响。MTT法检测Ply对RAW264.7细胞的增殖抑制。Annexin V法检测细胞凋亡率。分光光度法检测Caspase-3、8、9活性。免疫细胞化学法检测到Bax、Fas、Bcl-2蛋白的表达。结果:Ply对小鼠RAW264.7细胞有明显的增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖性;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞24小时后,可见典型的凋亡形态学改变;1μg/ml Ply处理RAW264.7细胞1小时和3小时后,细胞凋亡率分别为32.90%和51.56%(P<0.05);1μg/ml Ply蛋白处理RAW264.7细胞24小时,Caspase-3、8、9活性均比对照组升高(P<0.05);免疫细胞化学法检测到Bax、Fas表达较对照组增强,Bcl-2表达减弱(P<0.01)。结论:Ply可诱导小鼠RAW264.7细胞凋亡,诱导凋亡的机制可能是通过死亡受体/Fas途径和线粒体途径双重机制的介导实现。
- 董姗姗王虹贺潇李忱伟董杰姜慧袁军何於娟李岱容
- 关键词：RAW264.7细胞凋亡线粒体途径
- 小鼠急性中耳炎模型的建立被引量：4
- 2013年
- 目的:建立小鼠急性中耳炎模型并初步探讨其病理机制。方法:不同菌量肺炎链球菌TIGR4经鼓膜穿刺接种于C57BL/6小鼠中耳腔内,观察小鼠体重变化及发病情况,于接种后不同时间点取小鼠头部进行组织切片HE染色,取心脏血及中耳灌洗液,中耳灌洗液进行细胞计数、细菌铺板计数和细胞涂片瑞氏染色,并测定其上清和血清中细胞因子含量。结果:小鼠接种肺炎链球菌后,体重下降,呈剂量依赖方式。中耳粘膜增厚,上皮细胞坏死脱落,中耳腔内大量炎症细胞浸润。中耳腔内中性粒细胞的募集时相与细菌的清除时相呈相关性,中耳灌洗液中IL-6和TNF-α显著升高。结论:本研究成功构建了小鼠急性中耳炎模型,为进一步研究急性中耳炎发病机制奠定了实验基础。
- 周爱娥王维项云黄益飞董姗姗何於娟
- 关键词：急性中耳炎小鼠肺炎链球菌动物模型
