王伊琴
- 作品数：12 被引量：6H指数：2
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- 绵羊朊病毒受体37kD/67kD LRP/LR实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建被引量：2
- 2009年
- 为实时相对荧光定量PCR检测绵羊组织中朊病毒受体LRP/LRmRNA表达水平,构建目的基因LRP/LR、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线;根据GeneBank中绵羊37 kD/67 kDLRP/LR（LRP/LR）和β-actin基因编码区保守序列,设计特异引物;提取肠道组织mRNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后,与pGEM-T-easy载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α;质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定后,获得阳性LRP/LR,β-actin重组质粒;将阳性重组质粒107～102梯度稀释作为模板,然后进行实时荧光定量PCR;系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示产物溶解曲线峰值单一,说明无引物二聚体及引物特异性高;LRP/LR和-βactin标准曲线相关系数分别为r2=0.999,r2=0.997,说明线性关系好;重复性试验结果显示所构建的重组质粒10次同条件扩增均Ct值具有较好的重现性,且变异率均小于5%,说明标准曲线重复性好,稳定性高。说明成功构建目的基因LRP/LR,内参基因β-actin标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绵羊组织中朊病毒受体mRNA表达水平提供了基础。
- 乔俊文苏晓鸥赵德明李玉荣王伊琴
- 关键词：REAL-TIMEPCR绵羊重组质粒
- 热力学因素对绵羊重组朊蛋白体外构象转化的作用
- 2009年
- 构建了绵羊朊蛋白的原核表达载体,获得了高纯度的融合表达蛋白。并在热力学因素的作用下,研究了重组绵羊朊蛋白的构象转化。以基因型为ARQ/ARQ蒙古绵羊的血液DNA为模板,利用DNA重组技术,将绵羊朊蛋白正常成熟蛋白基因OvPrP插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL2l(DE3)中高效表达,获得的表达产物以包涵体形式存在,并对其进行纯化和复性。超滤浓缩后浓度约为0.5 mg/mL的OvPrP97-234,进行热力学处理,利用远紫外线圆二色谱(CD)分析热力学处理前、后蛋白的二级结构的变化,同时,对热力学处理前、后的蛋白进行了蛋白酶K抗性的检测,并对其高级结构进行了预测。结果表明:获得的表达产物经SDS-PAGE分析可见分子量为16kD的蛋白条带,Western-blotting的鉴定证实了所获得的蛋白是特异性的朊蛋白。经Jascow32软件分析,测得天然构象的OvPrP97-234的二级结构含量为:α螺旋为28.8%、β折叠为0%、转角和无规卷曲为71.1%,无蛋白酶K的抗性。经过热力学处理之后,OvPrP97-234的二级结构含量为:α螺旋为19.3%,β折叠为36.9%,转角和无规卷曲为43.8%,有一定的蛋白酶K抗性。绵羊重组朊蛋白的体外构象转化的分析为朊蛋白的体外构象转化机制和致病机理的研究提供科学依据。
- 王伊琴秦贞奎包勇敢乔俊文赵德明
- 关键词：原核表达圆二色谱
- 羊痒病夹心ELISA检测技术的研发及其应用
- 赵德明周向梅杨利峰尹晓敏王伊琴王进林敬钧李丽好赵化芬陈柏安神翠翠白玉常家鑫任伟郭又春
- 1.应用领域：该项目的成果可以应用于疯牛病、羊痒病检测和大通量的筛选、监测工作。2.研究开发内容：a、克隆表达羊PrP基因；b、纯化的表达产物免疫小鼠；c、制备抗PrP核心片段的单抗；d、检测单抗识别表位；e、以单抗为核...
- 关键词：
- 关键词：羊痒病检测试剂盒畜牧业
- 绵羊组织中朊病毒受体37kDa/67kDa LRP/LR mRNA转录水平研究被引量：1
- 2009年
- 本研究旨在检测绵羊组织中朊病毒受体37kDa/67kDa LRP/LR mRNA水平并探讨其与朊病毒组织嗜性的关系。选用背景相似的6只内蒙绵羊,提取组织RNA,反转录RT-PCR构建cDNA模板;利用本研究前期构建的标准质粒及标准曲线,对组织中该受体mRNA水平进行Real-time(实时)荧光定量PCR检测。结果表明,大脑皮质中的受体表达水平最高(P<0.05),其次为心脏和脑干,中等表达的器官依次为海马、小脑、脾脏、丘脑、肠系膜淋巴结、肝脏和肾脏,表达量最低为肺脏(P<0.05)。结果提示,朊病毒受体——37kDa/67kDa LRP/LR在绵羊各组织中的表达量高低与朊病毒的复制程度有一定的相关性,受体LRP/LR表达量较高的区域朊病毒复制水平相对较高。结果提示朊病毒入侵机体后,组织器官PrPSc聚集程度可能与受体37kDa/67kDa LRP/LR表达水平相关。
- 乔俊文苏晓鸥王伊琴周向梅杨建民尹晓敏马李颖赵德明
- 关键词：REAL-TIMEPCRMRNA绵羊PRPSC
- 一种重组牛朊蛋白bPrP及其制备方法和应用
- 本发明提供了一种重组牛朊蛋白bPrP及其制备方法和应用，bPrP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明以牛全血基因为模板，以SEQ IDNo3、4所示核苷酸序列为引物通过PCR方法获得带有酶切位点的牛朊蛋白...
- 杨利峰赵德明杨秀进王伊琴宋志琦周向梅尹晓敏赵化粉
- 文献传递
- 一种重组牛朊蛋白bPrP及其制备方法和应用
- 本发明提供了一种重组牛朊蛋白bPrP及其制备方法和应用，bPrP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明以牛全血基因为模板，以SEQ IDNo3、4所示核苷酸序列为引物通过PCR方法获得带有酶切位点的牛朊蛋白...
- 杨利峰赵德明杨秀进王伊琴宋志琦周向梅尹晓敏赵化粉
- 文献传递
- 一种重组绵羊朊蛋白oPrP及其制备方法和应用
- 本发明提供了一种重组绵羊朊蛋白oPrP及其制备方法和应用，oPrP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明以绵羊全血基因为模板，以SEQ ID No3、4所示核苷酸序列为引物通过PCR方法获得有酶切位点的绵羊...
- 杨利峰赵德明杨秀进王伊琴宋志琦周向梅尹晓敏李丽好
- 一种重组绵羊朊蛋白oPrP及其制备方法和应用
- 本发明提供了一种重组绵羊朊蛋白oPrP及其制备方法和应用，oPrP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明以绵羊全血基因为模板，以SEQ ID No3、4所示核苷酸序列为引物通过PCR方法获得有酶切位点的绵羊...
- 杨利峰赵德明杨秀进王伊琴宋志琦周向梅尹晓敏李丽好
- 文献传递
- 朊蛋白基因多态性、构象转化与神经毒性分子机制的研究
- 王伊琴
- 关键词：基因多态性朊病毒神经毒性
- 内蒙古地方品种绵羊朊蛋白基因多态性分析被引量：3
- 2009年
- 对中国内蒙古的乌珠穆沁羊(46)、苏尼特羊(34)和蒙古羊(22)进行朊蛋白基因的克隆和多态性分析。结果表明,发现了8个朊蛋白基因多态性位点,其中M157I、Q220H、R223K为未见报道的朊蛋白基因多态性位点;痒病中度易感的朊蛋白基因ARQ/ARQ占74.5%,具有痒病抗性朊蛋白基因ARR/ARR占7.9%,未检出对痒病高度易感的朊蛋白基因VRQ/VRQ。从基因水平上推论,乌珠穆沁羊携带的羊痒病抗性的ARR/ARR基因频率较高(15.2%),占ARR/ARR基因型的87.5%,发生羊痒病风险较低。该研究结果在中国活羊的出口贸易和品种选育方面有重要的意义,为出入境动物检疫中羊痒病的风险分析和风险评估提供重要的基础理论资料。
- 王伊琴秦贞奎包勇敢寇福军荆文奎乔俊文赵德明
- 关键词：朊蛋白基因易感性抗性羊痒病
