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温俊歌: 作品数：10 被引量：20H指数：3; 供职机构：西北农林科技大学动物医学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金“十二五”国家科技计划农村领域国家重点实验室开放基金更多>>; 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>

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猪淋巴结PKR基因的克隆与体外初步表达: 2011年; 【目的】克隆猪淋巴结双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)基因,并在体外初步表达,为研究流感病毒感染时猪PKR与P58IPK在体内外的相互作用奠定基础。【方法】用Trizol法从猪淋巴结中提取总RNA,RT-PCR法扩增猪PKR基因的完整编码区,将该片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pDsRed1-N1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pGEX-PKR在大肠杆菌BL21中的表达情况,用脂质体转染法将真核表达载体pD-sRed1-PKR转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs),Western blot检测其在细胞中的表达。【结果】PCR扩增得到了1 754bp的DNA片段,与预期结果一致;原核表达载体pGEX-PKR和真核表达载体pDsRed1-PKR经双酶切和核酸测序分析,表明载体构建成功;SDS-PAGE检测结果表明,pGEX-PKR重组质粒在大肠杆菌中成功表达;Westernblot检测到pDsRed1-PKR重组质粒在SUVECs中成功表达。【结论】成功克隆了猪淋巴结PKR基因,并在体外初步表达成功。; 孙岩胡健温俊歌郜原薄联锋徐志坤吴耀丽张德礼; 关键词：克隆原核表达真核表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒相关猪microRNA的初步筛选: 2012年; 本试验旨在初步筛选出与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染相关的猪microRNA(miRNA)。采用生物信息学方法预测可能与PRRSV 3′非编码区(3′utr)产生相互作用的猪miRNA,构建PRRSV 3′utr的双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK-utr,同时合成预测到的miRNA(ssc-miR-323、ssc-miR-105-1)及其相应的抑制物,共转染猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVEC),检测双荧光素酶活性。结果发现,ssc-miR-323与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率略有升高,ssc-miR-105-1与psiCHECK-utr共转染后,荧光比率降低。初步判定ssc-miR-323对PRRSV 3′utr没有抑制作用,而ssc-miR-105-1对PRRSV3′utr有一定的抑制作用。; 郜原薄联锋武小椿孙柏温俊歌孙岩徐志坤张德礼

猪P58IPK基因的克隆表达及甲型流感病毒感染对其表达的影响: P58是干扰素诱导、dsRNA激活的蛋白激酶PKR的胞内抑制剂。流感病毒感染后P58在翻译后水平激活,P58的激活导致PKR介导的eIF-2α磷酸化水平降低,使病毒蛋白表达水平增高,对病毒复制有利。然而,敲除P58的小鼠...; 温俊歌; 关键词：多克隆抗体 QRT-PCR 免疫组化; 文献传递

β-防御素在天然免疫中的作用被引量：12: 2011年; 天然免疫系统是宿主抵抗外界病原微生物入侵的重要组织系统。β-防御素是一类富含半胱氨酸和精氨酸的内源性阳离子低分子抗微生物短肽,主要分布于牛的骨髓以及人和多种动物的胃肠道、呼吸道、舌、牙龈、肾、皮肤的的上皮中,是先天性免疫的重要组成部分。β-防御素具有十分广泛的生物活性,对细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种病原体都具有杀伤作用,还对免疫细胞有趋化功能,并参与免疫调节,在天然免疫中发挥着重要的作用。; 孙岩王路温俊歌薄联锋徐志坤张德礼; 关键词：天然免疫 Β-防御素病原体趋化功能

猪P58IPK基因的克隆表达及甲型流感病毒感染对其表达的影响: P58IPK是干扰素诱导、dsRNA激活的蛋白激酶PKR的胞内抑制剂。流感病毒感染后P58IPK在翻译后水平激活,P58IPK的激活导致PKR介导的eIF...; 温俊歌; 关键词：多克隆抗体 QRT-PCR 免疫组化

猪Akirin2基因的定位及其影响IL-1β和IL-6 mRNA表达的研究被引量：4: 2011年; 本研究旨在研究猪新天然免疫相关基因Akirin2所表达的蛋白在细胞中的定位,以及在受到外源刺激物LPS刺激时,对细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达的影响。本试验用实验室构建好的pEGFP-Akirin2真核表达载体转染猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),用激光共聚焦显微镜分析Akirin2在SUVEC的定位,并用LPS作为外源刺激物刺激转染Akirin2基因的细胞,荧光实时定量分析细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量的变化。结果表明,Akirin2基因编码的蛋白严格定位于细胞核之内,并在核仁区有明显表达,在LPS刺激后,Akirin2基因对细胞因子IL-6和IL-1βmRNA表达量都具有明显上调作用。本研究证实了Akirin2蛋白的亚细胞定位及其对细胞因子表达的影响,为Akirin2基因的作用机制的进一步研究奠定了基础。; 徐志坤薄联峰温俊歌孙岩郜原吴江张德礼; 关键词：LPS 细胞定位细胞因子 QRT-PCR

猪新基因P58^IPK的分子克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：3: 2011年; 目的:分子克隆出猪P58IPK新基因,制备其多克隆抗体,为下一步研究流感病毒与宿主相互作用机制提供条件。方法:根据猪EST数据库,利用生物信息学方法,电子克隆猪P58IPK新基因;采用RT-PCR方法从猪淋巴组织分子克隆P58IPK基因完整开放阅读框(ORF),全长1 518 bp,编码505个氨基酸(GenBank登录号:HQ287801),并对其进行初步生物信息学分析;构建P58IPK原核表达载体pET-P58IPK,诱导表达并纯化重组的his-P58IPK融合蛋白,后免疫兔子制备多克隆抗体。结果:成功制备P58IPK多克隆抗体,通过双向琼脂扩散实验检测抗体有活性,ELISA鉴定血清中多抗效价达到1∶20 000,Western blot与免疫荧光检测反应特异性良好。结论:成功克隆猪新基因P58IPK,并制备了其多克隆抗体。; 温俊歌宋豪孙岩郜原徐志坤薄联锋张德礼; 关键词：多克隆抗体 WESTERN BLOT 免疫荧光

Thr-Ser-Ser位点对猪BCL10募集功能的影响被引量：1: 2011年; 在完整克隆出猪BCL10基因的基础上,用大引物PCR法构建3个真核表达载体:pEGFP-B(完整猪BCL10)载体、pEGFP-D(缺失CARD结构域)载体和pEGFP-P(缺失Thr-Ser-Ser位点)载体,转染猪血管内皮细胞(SU-VEC),观察其表达情况,以此研究Thr-Ser-Ser位点(富含TS区)对猪BCL10募集功能的影响。结果显示,pEGFP-B仅在胞质中表达,并呈短棒状,而pEGFP-D与pEGFP-P则在胞质和核内均有表达。表明CARD结构域参与猪BCL10募集过程,且Thr-Ser-Ser为CARD结构域中关键氨基酸位点,这为进一步研究猪BCL10功能和作用机制奠定了基础。; 薄联锋徐志坤郜原孙岩温俊歌张德礼

猪XCL1蛋白纯化、多克隆抗体的制备及其生物活性鉴定: 2011年; 目的:纯化获得体外表达猪his-XCL1的重组蛋白,制备多克隆抗体并研究其对淋巴细胞增殖的影响。方法:首先,采用HiTrapTM Chelating HP纯化方法,SDS-PAGE检测重组蛋白纯化情况,Western blot检测重组蛋白表达情况。再免疫动物制备多抗血清,双向琼脂扩散试验、间接ELISA检测多克隆抗体效价,MTT法检测猪XCL1对淋巴细胞增殖的影响。结果:当结合缓冲液的浓度为40 mmol/L,洗脱缓冲液500 mmol/L时,SDS-PAGE电泳可观察到有单一目的条带,Western blot显示重组蛋白成功表达,双向琼脂扩散试验证实抗原抗体的结合比为1∶8,间接ELISA检测到抗体水平达到1∶12 800。重组蛋白XCL1能促进淋巴细胞的增殖,而此实验制备的多克隆抗体可以阻断这种效应。结论:体外表达的重组蛋白具有生物活性,制备的多克隆抗体为研究XCL1在猪体中的功能提供科技资料。; 吴耀丽温俊歌孙岩张德礼; 关键词：多克隆抗体间接ELISA MTT

猪PDCD5基因的克隆与真核表达: 2011年; 用RT-PCR方法从猪肝组织中扩增出猪PDCD5(programmed cell death 5)编码序列,TA克隆至pMD-19T载体中,软件分析猪PDCD5基因的核算序列和蛋白序列,进行染色体定位.构建真核表达载体,将PDCD5基因编码区序列插入绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1中.通过脂质体转染法将重组载体瞬转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs)进行瞬时表达.结果表明:该序列编码125个氨基酸,猪PDCD5基因定位于猪6号染色体,含有6个外显子,与人PDCD5基因高度同源.双酶切鉴定和测序表明:重组真核表达载体构建成功,荧光检测和Western blot检测显示PDCD5融合蛋白表达.研究结果为探讨猪PDCD5基因在细胞凋亡调控中的功能提供了基础数据.; 胡健王静娜陈新雨温俊歌徐瑶钟瑜张德礼; 关键词：CELL 克隆真核表达

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