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牛和小鼠胎儿成纤维细胞混合制成的饲养层对牛胚胎干细胞的体外培养被引量：1: 2012年; 【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)和牛胎儿成纤维细胞(bovine embryonic fibroblast,BEF),用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞比单独生长在小鼠或牛胎儿成纤维细胞饲养层的结构致密、与滋养层界限明显;②小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞在1﹕1比例混合下牛胚胎干细胞克隆结构致密、显著堆积且边缘轮廓清晰优于其它比例组合;③获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT4、SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体。【结论】小鼠和牛胎儿成纤维细胞在以1﹕1的比例混合下制成的饲养层可更好地支持牛胚胎干细胞的体外培养,获得的克隆形态最好。; 丛姗王瑞温建勋郝斐李硕梁浩刘东军; 关键词：胚胎干细胞成纤维细胞

马羊膜上皮干细胞的分离培养和鉴定: 2015年; 通过Tryp LE消化马羊膜收集羊膜上皮细胞,经过传代培养后,用免疫荧光染色、RT-PCR及流式细胞技术(FACS)分析其干细胞特征。免疫荧光染色发现马羊膜上皮细胞表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81,只有少量的半贴壁细胞表达Oct4;RTPCR进一步证实马羊膜上皮细胞表达Oct4、Nanog和Sox2,而不表达STAT-3;流式细胞技术分析显示马羊膜上皮细胞也表达CD44、CD90、CD105,但不表达CD45。马羊膜上皮细胞培养三代时,平均倍增时间为(1.25±0.17)d。研究结果表明,通过Tryp LE消化马羊膜上皮可以分离获得马羊膜上皮细胞。; 张福全丛姗温世勇郭继彤曹贵方; 关键词：羊膜上皮干细胞

不同饲养层对牛胚胎干细胞培养效果的影响: 虽然围绕牛胚胎干细胞建系已进行了大量的研究，但迄今为止仍未建立适合牛胚胎干细胞的环境条件。探索一种适合其生长的饲养层保持未分化状态，对保证干细胞的全能性具有重要意义。本实验采用两种不同饲养层培养的牛胚胎干细胞，采用形态学...; 丛姗; 关键词：实时荧光定量

人羊膜间充质干细胞移植对CCl_4诱导的小鼠损伤肝HGF、SIRT-1、α-SMA及P^(27kip1)表达的影响被引量：6: 2015年; 人羊膜间充质干细胞(h AMSCs)具有自我增殖和多向分化潜能,有望为干细胞移植性治疗提供新来源,是病变组织器官损伤修复的理想种子细胞.但目前关于h AMSCs对肝损伤的修复机制仍不十分清楚.本研究采用胰蛋白酶-胶原酶消化法从羊膜组织中分离、纯化了间充质干细胞.免疫荧光检测表面标记波形丝蛋白(vimentin)和阶段特异表达抗原4(SSEA-4)均呈阳性.h AMSCs表达CD29、CD49d、CD73表面抗原,但不表达骨髓间充质表面抗原CD34、CD45和人类白细胞抗原DR位点(HLA-DR).实时定量PCR和Western印迹检测揭示,h AMSCs移植后可提高受损肝组织中肝细胞生长因子(HGF)和沉默信息调节因子1(SIRT-1)的表达,抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和周期性蛋白依赖性激酶抑制因子(P27kip1)的表达.因为上述蛋白质分子涉及肝细胞增殖、再生、凋亡调节,抑或肝纤维化过程,因此h AMSCs移植后所引起的上述分子表达变化可改善四氯化碳(CCL4)诱导的肝损伤,抑制肝细胞凋亡,促进肝细胞有丝分裂,对肝损伤有一定的修复作用.该研究为进一步探索调控肝再生、损伤修复信号通路(机制)及预防肝纤维化提供了新启示.; 丛姗白立恒李岩宋瑾曹贵方; 关键词：人羊膜间充质干细胞

人羊膜间充质干细胞归巢至小鼠急性损伤肝组织及其致瘤性被引量：3: 2016年; 将小鼠随机分为治疗组和对照组,按20μL/g的剂量腹腔注射10%CCl4溶液,每周2次,连续注射4周,建立小鼠急性肝损伤模型。建模后24h,治疗组尾静脉移植经Dir标记的人羊膜间充质干细胞0.2mL;对照组移植等量未经Dir标记的人羊膜间充质干细胞。使用小动物活体成像系统观察人羊膜间充质干细胞在小鼠体内分布。将NOD/SCID小鼠随机分为3组,试验组注射0.2 mL人羊膜间充质干细胞细胞悬液,阳性对照组注射0.2 mL Hep G2细胞悬液,阴性对照组只注射等量Matrigel和PBS的1∶1混合液。60d后脱颈处死小鼠,观察肿瘤形成情况并进行病理组织学检查。结果显示,活体成像试验发现,人羊膜间充质干细胞移植后2h,全身只有肝脏区域有荧光,人羊膜间充质干细胞移植后1d,肝脏及肺脏附近荧光信号达到最强,移植3d,肺部强荧光消失,肝部附近强荧光仍存在,移植后7~30d,全身各处荧光信号消失,但肝部荧光信号持续存在。体内致瘤试验发现,阳性对照组小鼠有肿瘤形成,而注射人羊膜间充质干细胞的试验组小鼠和阴性对照组小鼠均未观察到肿瘤形成。结果表明,人羊膜间充质干细胞尾静脉移植入急性肝损伤小鼠,可以成功归巢至肝脏并长期定植存在;人羊膜间充质干细胞在体内没有致瘤性,具有一定的临床安全性。; 李岩丛姗宋瑾张钰堃白立恒曹贵方; 关键词：人羊膜间充质干细胞 NOD SCID小鼠致瘤性

人羊膜间充质干细胞分离培养:胰蛋白酶及胶原酶消化时间及浓度的选择被引量：3: 2014年; 背景:文献报道人羊膜间充质干细胞提取方法各不一致,得到的细胞数量各不相同。目的:探索人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。方法:无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片,分别通过4个实验7种方法体外培养人羊膜间充质干细胞。①实验一:分别采用3种方法:0.05 g/L胰蛋白酶消化10 min后,再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min;0.75 g/L胶原酶Ⅰ直接消化120 min;0.05 g/L胰蛋白酶与0.75 g/L胶原酶Ⅰ同时消化60 min。②实验二:采用0.05 g/L的胰蛋白酶消化30 min后,再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化30 min。③实验三:分别采用2种方法:0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后,再加入0.75 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min;0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化40 min后,再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min。④实验四:采用0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后,再加1 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min。显微镜下观察其形态,研究人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。结果与结论:用0.05 g/L的胰蛋白酶连续消化2次每次消化30 min,然后用1 g/L的胶原酶消化60 min是最合适的体外分离培养条件。细胞成细长梭形或星形,胞质丰富,细胞核呈圆形,1-3个核仁。说明实验四采用的胰酶和胶原酶消化的时间合适,而且胶原酶的浓度合适,得到的细胞数量最多。; 张惠娟丛姗梁美萍刘俊平黄利刚宋瑾曹贵方; 关键词：干细胞间充质干细胞羊膜间充质干细胞细胞培养胰蛋白酶胶原酶

马羊膜上皮细胞分离、培养及影响因素的研究: 2014年; 为了建立马羊膜上皮细胞(equine amniotic epithelial cells,e AECs)的分离、培养方法,并对其影响因素进行研究,试验从胎盘剥离羊膜,采用Trypsin-乙二胺四乙酸(EDTA)或Tryp LE消化法分离获得上皮细胞,然后进行上皮细胞培养传代研究。结果表明:通过0.25%Trypsin-EDTA消化,每克羊膜平均获得2.2×106个细胞,其3代传代倍增时间平均为(1.32±0.21)d;通过0.25%Tryp LE消化,每克羊膜平均获得1.9×106个细胞,其3代传代倍增时间平均为(1.26±0.17)d,两者间差异显著(P<0.05)。Tryp LE消化结果比较稳定,更适合从马羊膜层消化、分离上皮细胞。; 张福全温世勇丛姗郭继彤曹贵方

人羊膜间充质干细胞抑制肝损伤小鼠淋巴细胞增殖和干扰素-γ分泌的研究: 2015年; 为了研究人羊膜间充质干细胞(h AMSCs)进入损伤动物体内后对动物机体免疫相关指标的影响,探究人羊膜间充质干细胞免疫原性,试验采用两步酶消化人羊膜组织分离培养h AMSCs,用流式细胞技术和免疫荧光的方法鉴定细胞表面分子;将CCl4橄榄油混合液按体重比腹腔注射到小鼠体内造肝损伤模型,损伤后的小鼠尾静脉注射h AMSCs,观察小鼠30 d内外周血中淋巴细胞和血浆中γ-干扰素(IFN-γ)的变化。结果表明:试验分离得到较高纯度的h AMSCs细胞;尾静脉注射细胞的肝损伤小鼠与未注射细胞的肝损伤小鼠相比,注射细胞的小鼠体内淋巴细胞数量有所降低;损伤小鼠体内血浆中IFN-γ含量随着h AMSCs注入时间的延长也逐步降低。h AMSCs进入肝损伤小鼠体内不引起淋巴细胞发生增殖,也不诱发分泌IFN-γ,反而降低动物体内的免疫功能。说明h AMSCs具有低免疫原性,可能使其进入机体后不被免疫细胞识别,从而能够在机体内修复脏器。; 丛姗宋瑾李岩白立恒曹贵方; 关键词：肝损伤

人羊膜间充质干细胞定位修复四氯化碳诱导小鼠肝损伤的研究: 肝脏是人体内功能最多的代谢和解毒器官，具有多种生理功能参与体内消化、代谢、解毒和免疫等过程，因此，肝脏损伤可引起动物和人体的衰老病变和其他疾病的发生。目前，严重的肝脏疾病目前还没有找到一种完全能治愈的措施和治疗方法。由于...; 丛姗; 关键词：肝损伤四氯化碳人羊膜间充质干细胞

人羊膜间充质干细胞抑制异体淋巴细胞增殖并减少γ干扰素的分泌被引量：4: 2015年; 目的观察人羊膜间充质干细胞(hAMSC)对体外培养的淋巴细胞功能的影响。方法通过酶消化法分离培养hAMSC,采用荧光团标记的小鼠抗人单克隆抗体结合流式细胞术鉴定细胞表面抗原;免疫荧光染色检测培养细胞波形蛋白(vimentin)和阶段特异表达抗原4(SSEA-4)的表达;分离培养hAMSC和外周血单个核细胞(PBMC),将刀豆蛋白(ConA)刺激的淋巴细胞与1×104、5×104、1×105个hAMSC进行共培养。CCK-8法测定淋巴细胞增殖,ELISA测定细胞上清液中IFN-γ的水平。结果5μg/mLConA能够引起淋巴细胞增殖;共培养条件下,hAMSC能够抑制ConA引起的淋巴细胞增殖,且随着hAMSC的数量增加,抑制效果更明显。培养72h后,CCK-8法结果表明,单纯ConA刺激后淋巴细胞数显著高于共培养细胞。选择抑制效果最佳的组别1×106个淋巴细胞与1×105个hAMSC共培养,ELISA测定1×105个hAMSC对淋巴细胞抑制72h后,上清液中IFN-γ分泌,共培养细胞上清液中IFN-γ水平显著低于单纯ConA刺激细胞。结论hAMSC能在体外抑制ConA引起的淋巴细胞增殖并减少IFN-γ分泌。; 宋瑾丛姗李岩白立恒曹贵方; 关键词：人羊膜间充质干细胞干扰素-Γ 免疫抑制

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丛姗

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