陕西中医药大学基础医学院生物学教研室
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- pSilencer 3.1-Sirt3基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定
- 2017年
- 目的构建Sirt3基因的RNA干扰载体,并在真核细胞中进行pSilencer 3.1-Sirt3的功能鉴定。方法利用体外DNA合成技术及液相色谱纯化技术合成Sirt3干扰序列,通过酶切将干扰序列连接至pSilencer 3.1载体中,将阳性克隆载体转入感受态大肠杆菌细胞后,筛选阳性克隆,通过第二代体外DNA测序技术进行序列测定。将测序正确的克隆用于Western blot实验和real time PCR实验,以对其在真核细胞中的正确表达和内源性Sirt3的干涉效果进行鉴定。结果 PCR扩增得到序列测定结果与干扰序列完全一致。构建的pSilencer 3.1-Sirt3质粒在AGS和SGC-7901细胞中进行基因的转染,pSilencer3.1-Sirt3能够有效抑制内源性Sirt3的mRNA水平和蛋白质水平的表达。结论成功构建获得Sirt3干扰载体,并有效降低Sirt3的mRNA和蛋白质水平的表达,为今后Sirt3的功能研究提供良好的基础。
- 曲璇李军马晓军韩洛川史海龙
- 关键词：RNA干扰
- SKP2突变载体S72A和S72D的构建以及生物学功能研究
- 2017年
- 目的构建SKP2突变载体SKP2S72A和SKP2S72D并验证其生物学功能。方法利用一步法PCR合成含有SKP2S72A和SKP2S72D突变序列,通过酶切连接将序列插入p Babe载体中,将克隆载体转入大肠杆菌后,筛选阳性克隆进行序列测定,将鉴定正确的克隆转染HEK293细胞,并利用Western blot实验鉴定基因表达及其对靶蛋白P27的影响。结果PCR扩增得到序列测定结果与预期序列完全一致;构建的SKP2S72A和SKP2S72D突变质粒,用于基因转染纯度较好,在真核细胞中成功表达,并且影响了P27的蛋白水平。结论构建获得SKP2突变载体,为今后SKP2泛素连接酶活性的功能研究提供良好的基础。
- 曲璇李军马晓军韩洛川史海龙
- 关键词：S期激酶相关蛋白
