郧阳医学院第三临床学院临床医学研究所
- 作品数：14 被引量：57H指数：3
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- 细菌内同源重组构建pAdeasy-1/hp27mt腺病毒质粒被引量：9
- 2003年
- 目的 :采用细菌内同源重组法高效制备含hp2 7mt基因的重组腺病毒质粒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,亚克隆至腺病毒穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,构成穿梭质粒 pShuttle -CMV/hp2 7mt;然后再用经PmeI酶切的 pshuttle-CMV/hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAdeasy - 1 /hp2 7mt;筛选同源重组质粒阳性克隆 ,提取pAdeasy - 1 /hp2 7mt质粒经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定。结果 :线性化的pShuttle-CMV/hp2 7mt转化含pAdeasy - 1的超感受态BJ51 83 ,1 2 - 2 0h后获得了30 %阳性重组质粒克隆 ,经酶切获得一大于 2 0kb的大片段和 3 .0kb的特征性片段 ,PCR反应扩增出了 2 75bp的片段 ,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因hp2 7mt。 结论 :用细菌内同源重组法可制备含hp2 7mt的重组腺病毒质粒且经济高效、简便、快捷。为转染 2
- 陈珺徐少勇邓长生王家宁黄永章
- 关键词：细菌同源重组
- 重组人红细胞生成素促进体外培养的人骨髓间充质干细胞增殖被引量：1
- 2008年
- 为了观察重组人红细胞生成素(rhEPO)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖活性的影响,抽取健康志愿者的骨髓液,贴壁培养获取第3代细胞,通过细胞形态特征、细胞表面抗原及诱导分化的方法进行MSCs鉴定;取经过鉴定的第3代MSC(P3-MSC)加入不同浓度rhEPO(0.5、1、5、10、50U/ml)后培养,应用细胞计数法及MTT法检测细胞增殖,用流式细胞术(FCM)分析细胞周期。结果发现:骨髓贴壁培养获取的第3代细胞同时表达CD105和CD90,不表达CD34和CD45,并可被诱导分化为脂肪、骨及软骨细胞,被鉴定为MSC。MTT结果显示EPO处理组的光密度值(OD)均高于对照组(p<0.05);50U/ml浓度EPO组作用最显著,细胞计数法获得的结果与其一致。FCM细胞周期分析表明,rhEPO能明显降低G0/G1期细胞比例,并提高S+G2/M期细胞比例,与对照组相比,差异均具有显著统计学意义(p<0.01)。结论:EPO能促进体外培养的人骨髓MSCs增殖,该效应与EPO调节其进入细胞增殖周期有关。
- 曾琴兵程范军张卫国唐俊明陈龙刘歧焕高清平王家宁
- 关键词：红细胞生成素间充质干细胞细胞周期
- 86例STD患者心理状态分析及心理治疗体会被引量：7
- 2005年
- 王雄孔霞鲁英涂亚庭
- 关键词：STD患者心理状态心理治疗性传播疾病
- 粒细胞集落刺激因子促进骨髓源间充质干细胞活性的机制被引量：3
- 2009年
- 本文旨在探讨粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)促进骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)活性的机制。采用经典的全骨髓贴壁法培养MSCs,通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记(CD133、CD34、CD90、CD105)等鉴定MSCs特征;以第三代MSCs为实验材料,采用MTT法分析G-CSF(20μg/mL)对MSCs活性的影响。随后以50nmol/L wortmannin(磷酰肌醇-3激酶阻断剂)、50μmol/LPD98059(细胞外信号调节激酶阻断剂)、30μmol/LSB203580(丝裂原活化蛋白激酶阻断剂)、10μmol/LH89[蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂]、20μmol/LY27632(Rho激酶特异抑制剂)、1μmol/Lrapamycin[雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)特异性阻断剂]、10mmol/L straurosporine[蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)阻断剂]、6nmol/LG0697(PKCα抑制剂)、50μmol/L Pseudo Z(PKCζ抑制剂)等分别处理MSCs,观察G-CSF影响MSCs活性的信号机制。结果显示,培养的第三代MSCs呈现出CD90、CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;G-CSF促进MSCs活性,H89、Y27632、PseudoZ不能抑制G-CSF对MSCs的激活作用,wortmannin、rapamycin、PD98059、SB203580、G0697部分抑制G-CSF对MSCs的激活作用,straurosporine可完全抑制G-CSF对MSCs的激活作用。以上结果提示,G-CSF激活MSCs效应与AKT-mTOR-PKC途径密切相关,且PKC处于中心环节。
- 陈龙程范军刘岐焕唐俊明曾琴兵孔霞郭凌郧王家宁
- 关键词：粒细胞集落刺激因子间充质干细胞蛋白激酶C
- 人突变p27重组腺病毒的构建及其在结肠癌细胞SW480中的表达
- 2003年
- 目的 :为了探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变 p2 7的抗肿瘤特性 ,构建复制缺陷型重组hp2 7mt基因腺病毒。 方法 :hp2 7mt自载体pORF9-hp2 7mt中切出 ,经 2次亚克隆 ,插入到穿梭质粒 pShuttle -CMV中 ,形成转移质粒 pShuttle -CMV -hp2 7mt;然后再用PmeI线性化的 pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含腺病毒骨架质粒 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183,使其在细菌内发生同源重组。重组质粒鉴定正确后经PacⅠ酶切 ,转入Ad2 93细胞 ,包装成重组腺病毒Ad -hp2 7mt。采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定 ,用紫外分光光度计进行滴度测定。用重组 p2 7mt的腺病毒Ad - p2 7mt感染大肠癌细胞SW 4 80 ,WesternBlot检测p2 7蛋白的表达。结果 :用含pShuttle -CMV -hp2 7mt转化含 pAdeasy - 1的超感受态BJ5 183后 ,可获得约 30 %的阳性重组质粒。PCR检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因。重组腺病毒滴度为 7.95× 10 15pfu/L。转染大肠癌细胞后 ,p2 7在SW4 80中获得了高表达 ,而未转染细胞和Ad -LacZ转染的细胞中仅有低表达。结论 :腺病毒作为一种基因转移载体 ,可有效介导 p2 7在肿瘤细胞中的表达 ,在肿瘤基因治疗方面具有很大的应用前景。
- 陈珺徐少勇邓长生王家宁黄永章
- 关键词：重组腺病毒结肠癌细胞SW480细胞周期素CDK
- 重组腺病毒介导的p27Kip1基因治疗大鼠神经胶质瘤的实验研究被引量：2
- 2006年
- 目的研究腺病毒介导的人p27Kip1基因(Ad-p27Kip1)对大鼠神经胶质瘤生长的抑制作用。方法建立大鼠胶质瘤模型,随机分成3组:Ad-p27Kip1组、Ad-LacZ和对照组,分别给予Ad-p27Kip1、Lacz重组复制缺陷性腺病毒(Ad-LacZ)和PBS瘤内注射,观察对肿瘤生长的抑制情况,并用免疫荧光法检测p27和细胞周期素(cyclinD1)的表达;原位末端标记法检测细胞凋亡情况。结果Ad-p27Kip1组肿瘤生长受到明显抑制(P<0.05),免疫荧光染色显示移植瘤p27表达明显增强(P<0.05),cyclinD1的表达受到明显抑制(P<0.05),且细胞凋亡显著多于Ad-LacZ组和对照组(P<0.05)。结论Ad-p27Kip1对大鼠胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,其机制可能是增强p27表达、抑制cyclinD1表达。p27Kip1有望成为胶质瘤基因治疗的新策略。
- 赵斌杰赵洪洋戢翰升王家宁潘国栋
- 关键词：胶质瘤P27KIP1基因治疗细胞凋亡
- 组织型纤溶酶原激活因子基因真核表达质粒的构建及其体外表达研究被引量：1
- 2006年
- 目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(t-PA)基因的新型真核表达载体pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA,并观察其在人脐静脉内皮细胞株(hUVEC)中的表达情况。方法将t-PA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1-Myc-His B(-)中,经脂质体介导将pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA导入hUVEC,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测t-PA基因在转染细胞内的转录水平,免疫印迹法(Western blot)检测转染细胞t-PA蛋白表达,底物发色法检测转染细胞t-PA活性。结果经双酶切鉴定和测序证实已将t-PA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,转基因组、空载体组、转绿色荧光蛋白组和空白对照组hUVEC t-PA mRNA相对含量分别(0.92±0.22)(、0.32±0.17)(、0.35±0.17)和(0.27±0.17),转t-PA基因组明显高于对照各组,其细胞培养上清t-PA活性分别为(48.90±8.06)、(5.44±1.09)(、5.17±0.95)和(5.01±1.03)U/106细胞.24h,转t-PA基因组t-PA活性明显高于各对照组(均P<0.01)。用抗Myc标签抗体可检测到转t-PA基因组外源性蛋白质表达,对照组则为阴性。结论成功构建pcDNA3.1-Myc-His B(-)/t-PA基因新型真核表达载体,并能在hUVEC中表达,从而为血栓性疾病的基因治疗研究奠定了基础。
- 刘小斌张凯伦蒋雄刚王家宁黄永章
- 关键词：组织型纤溶酶原激活因子真核表达载体
- 补肾益气化瘀方对衰老大鼠海马神经元的影响被引量：2
- 2008年
- 目的观察补肾益气化瘀方对衰老大鼠海马神经元结构的影响,并探讨其作用机制。方法选用青年Wistar大鼠36只,随机分成三组:空白对照组、模型对照组、药物组。使用D-半乳糖腹腔注射建立亚急性衰老大鼠模型。模型建立后,药物组每天用补肾益气化瘀方提取液灌胃,空白对照组、模型对照组用生理盐水灌胃,连续四周。然后用光学显微镜观察海马神经元结构,用紫外分光光度计检测大鼠海马超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。结果空白对照组:海马轮廓清晰,CA3区神经元细胞密集,胞浆丰富,核大深染,细胞间排列整齐,界限清楚;模型对照组:海马轮廓模糊,神经元细胞明显减少,细胞间排列松散,界限不清;药物组:海马轮廓清晰,神经元细胞明显多于模型对照组,神经元胞浆较丰富,核大深染,细胞间排列较整齐,界限清楚。模型对照组海马MDA含量增加,SOD活性减少;与模型对照组比较,药物组海马超氧化物歧化酶(MDA)含量减少,SOD活性增加(P<0.01)。结论补肾益气化瘀方对衰老大鼠海马神经元具有保护和修复作用,其机理可能与抗自由基损伤有关。
- 陶连方吴力萍龚晓强王贤斌王家宁刘雨银
- 关键词：海马神经元D-半乳糖衰老
- 腺病毒介导的人突变p27基因转染对人大肠癌细胞系的作用被引量：2
- 2004年
- 目的 用人重组p2 7mt腺病毒感染大肠癌细胞株SW 480 ,研究p2 7mt对大肠癌细胞的抑制作用。方法 用重组腺病毒Ad -p2 7mt转染SW 480后 ,用Westernblot检测目的基因的表达 ;用流式细胞仪对转染细胞进行倍体分析 ,绘制生长曲线观察对细胞的生长抑制作用。结果 Ad -p2 7mt转染SW 480后 ,通过Westernblot分析发现p2 7在细胞中出现了高表达 ;PI染色流式细胞仪检测 ,77 9%的细胞阻滞于G0 /G1 期 ,而Ad -LacZ组及空白对照组分别为 2 5 5 7%和 2 5 2 9%(P <0 0 0 1) ;由生长曲线可以看出Ad -p2 7mt于 2 4h内对细胞就有明显的抑制作用 ( P<0 0 5 ) ,且持续时间长。结论 重组腺病毒能够有效转染p2 7mt基因进入SW480细胞内并获得了高表达 ;p2 7mt对细胞周期有明显的阻滞作用且对细胞的生长有明显的抑制作用。突变p2 7是一种细胞周期高效阻滞因子和高效生长抑制因子 ,为p2
- 陈珺徐少勇邓长生王家宁黄永章
- 关键词：腺病毒介导作用基因突变P27基因转染大肠癌细胞系
- 人突变p27基因转染大肠癌细胞凋亡的实验研究被引量：2
- 2005年
- 目的:探讨人突变p27基因对大肠癌细胞凋亡的诱导作用。方法:构建重组腺病毒Ad-p27mt,转染大肠癌细胞SW480,用流式细胞仪、DNA片段分析法、TUNEL法观察Ad-p27mt对大肠癌细胞凋亡的诱导作用。结果:成功构建了Ad-p27mt,在感染复数≥50时,可达100%的转导效率。Ad-p27mt转染SW48024h后流式细胞仪检测在G1期前出现了亚二倍体凋亡峰,细胞DNA提取电泳后出现了凋亡特征性梯带,TUNEL法检测凋亡指数实验组和对照组分别为82·6±3·2和5·0±3·5,差异显著(P<0·01)。结论:人突变p27基因能有效诱导大肠癌细胞的凋亡。
- 陈珺徐少勇熊玲王家宁黄永章
- 关键词：结直肠肿瘤细胞凋亡
