中山大学中山医学院生物化学教研室
- 作品数：70 被引量：220H指数：7
- 相关作者：卢汉平陈菲梅玉屏程锐李巧艳更多>>
- 相关机构：中国人民解放军第一军医大学第二附属医院广州医学院公共卫生学院广州医学院公共卫生学院化学致癌研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金广东省科技计划工业攻关项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 抗新生血管蛋白KBP多克隆抗体的制备及鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的激肽释放酶结合蛋白(Kallikrein-binding protein,KBP)具有抑制血管新生的高活性,但目前尚无KBP的特异性抗体,限制其进一步研究。本研究拟制备高灵敏度和高特异性的KBP抗体并对其进行初步评估。方法构建含大鼠源性KBP序列的pET-28a重组载体的大肠杆菌BL21(DE3),在此基础上,扩增表达菌,经异丙基B.D一硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA色谱柱亲和层析纯化获得KBP重组蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot方法对KBP进行鉴定。以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔,获得兔抗KBP血清,亲和纯化获得多克隆抗体。应用Elisa和Western-blot方法检测纯化抗体的效价和特异性。结果 KBP融合蛋白得到高表达,且纯度大于85%。用该融合蛋白免疫大白兔后得到的抗KBP抗体,效价达1∶512 000,并特异性识别大鼠和人组织中天然的KBP蛋白。结论以纯化的KBP重组蛋白为抗原,获得KBP多克隆抗体,具有较好的效价和特异性,为KBP功能和作用机制的深入研究提供了必要的工具。
- 陈易斐黄莉钧李磊戴智育程锐杨霞高国全
- 关键词：多克隆抗体制备
- 一种高选择性、高效的牛视网膜微血管内皮细胞培养方法被引量：5
- 2012年
- 目的建立一种高效、可行、特异性高的牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)培养方法。方法取新鲜牛眼,分离视网膜并用DMEM进行冲洗、匀浆剪碎,过75μm筛,将滤网上滤渣转移至50ml离心管,用Ⅰ型胶原酶、DNaseⅠ及蛋白酶等多种酶混合液消化20min,人血清中和后,过46μm网筛并冲洗,离心5min,将组织扣在培养皿中,转入15ml离心管,用10%人血清含生长因子ECGS的DMEM培养液培养于25cm2,选择性培养视网膜血管内皮细胞,接种于明胶包被培养瓶中,采用ECGS配合肝素培养液促进内皮细胞生长,观察细胞形状生长特性,并用免疫化学荧光方法进行鉴定。结果选择性培养视网膜微血管内皮细胞成单层、镶嵌铺路石状生长,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测为阳性纯度均大于95%以上,将细胞种在凝固的基质胶表面,12～18h形成官腔结构。结论本方法过程简单、可靠,培养的内皮细胞纯度高,生长状态良好,稳定传代,为视网膜血管生成疾病研究建立了模型。
- 王征齐炜炜陈少波戴智育陈大伟程锐高国全杨霞
- 关键词：视网膜微血管内皮细胞细胞培养
- 反义核酸抑制B16黑色素瘤细胞tyr基因的表达
- 2005年
- 目的:用反义核酸技术抑制小鼠B16黑色素瘤细胞酪氨酸酶基因(tyr)的表达。方法:构建tyr反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr,用脂质体法导入B16细胞,用酪氨酸酶活性及黑色素含量测定,多巴染色及透射电镜等检测由反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr转录产生的tyr反义核酸对B16细胞tyr表达的抑制情况。结果:成功构建了反义重组体pcDNA3.1(-)-tyr,转染了反义重组体的B16细胞其酪氨酸酶活性为0.0498±0.0036,显著低于对未转染组B16细胞的0.0916±0.0132(P<0.01);转染空质粒pcDNA3.1(-)及真核表达重组体pcDNA3.1(+)-tyr组B16细胞的氨酸酶活性分别为0.1015±0.0166和0.0948±0.0096,两者同对照组相比均无显著差异(P>0.05)。多巴染色及电镜观察结果表明转染了反义重组体的B16细胞其黑色素颗粒的含量明显低于对照组。结论:反义核酸可以显著抑制B16黑色素瘤细胞tyr的表达。
- 吉琼梅朱振宇王晓华张东方张海涛李秀英马涧泉
- 关键词：核苷酸反义黑色素瘤基因
- 重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达被引量：2
- 2003年
- [目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。
- 吉琼梅朱振宇张海涛李秀英岳滔李茜马涧泉
- 关键词：黑色素瘤酪氨酸酶基因基因表达RT-PCR法
- TNF-α诱导小鼠B16黑色素瘤细胞凋亡及其对小鼠B16细胞移植瘤生长的抑制作用被引量：2
- 2004年
- 目的:探讨TNF-α对小鼠B16黑色素瘤(MM)细胞凋亡的诱导及其对小鼠B16移植瘤生长的抑制作用。方法:用不同浓度的TNF-α直接作用于培养的小鼠B16黑色素瘤细胞,36h后,采用流式细胞仪(FCM)及原位末端标记法(TUNEL法)检测B16细胞的凋亡率。动物实验观察TNF-α小量瘤体内注射对小鼠B16移植瘤生长的抑制作用。结果:在1000、3000、5000及10000U/mLTNF-α作用下,B16细胞的凋亡指数均明显高于空白对照组(P<0.01),随着TNF-α浓度增加,B16凋亡细胞数呈增加趋势。动物实验结果显示,TNF-α治疗3周后,治疗组荷瘤小鼠MM移植瘤的体积和重量明显低于对照组(P<0.01)。结论:TNF-α能够诱导小鼠B16黑色素瘤细胞发生凋亡,且小剂量TNF-α瘤体内注射能显著抑制小鼠移植性MM的生长。
- 吉琼梅朱振宇王晓华李秀英李民友冯哲玲马涧泉
- 关键词：TNF-Α黑色素瘤细胞细胞凋亡恶性黑色素瘤
- 广州市门诊5岁以下儿童诺如病毒感染基因型分析被引量：2
- 2010年
- 目的了解2007-2008年广州市监测点医院门诊5岁以下儿童病毒性腹泻散发病例中诺如病毒感染状况及基因型别。方法收集广州市2007-2008年监测点医院门诊临床诊断为病毒性腹泻的患儿临床资料及粪便标本954份,采用ELISA方法检测诺如病毒、轮状病毒,将诺如病毒抗原阳性的标本用RT-PCR方法进行诺如病毒核酸扩增,将阳性产物回收、纯化并测序,结合GenBank中的相关序列进行型别流行特点分析。结果 954份标本中,ELISA方法检测各种病毒的抗原阳性率为诺如病毒18.8%(179/954),其中07年12.2%(32/262),08年21.2%(147/692),轮状病毒30.8%。诺如病毒腹泻病例发病高峰在8～11月份,2岁以下病例数占全部病例的91.6%,病例集中在6～23月龄。RT-PCR方法检测诺如病毒核酸阳性率为80.4%(144/179),144份诺如病毒核酸阳性标本经测序及与GenBank中的相关序列比对证实有1份是GⅡ2型,其余全部为GⅡ4型。结论诺如病毒是广州市门诊5岁以下儿童病毒性腹泻的常见病原之一,仅次于轮状病毒,常见于2岁以下婴幼儿,2007-2008年流行优势株基因型为GⅡ4型。
- 沈纪川刘于飞谢华萍李巧艳蒋力云吴新伟魏跃红陈坤才
- 关键词：诺如病毒基因型病毒性腹泻
- 大剂量葡萄糖诱导人视网膜内皮细胞凋亡被引量：9
- 2003年
- 目的检验大剂量葡萄糖水平对培养的原代人视网膜毛细血管内皮细胞(humanretinalcapillaryendothelialcells,HRCEC)的直接影响。方法HRCEC细胞从捐赠人眼中分离得到。细胞在含有5mmol/L或25mmol/L葡萄糖的培养基中培养6d。应用锥虫蓝染色测定细胞活力、流式细胞计数分析细胞周期、TUNEL分析细胞凋亡。结果HRCEC细胞在25mmol/L葡萄糖中培养6d,细胞活力显著下降。通过流式细胞计数和TUNEL测定,凋亡细胞的数目在大剂量葡萄糖培养基中显著升高。结论大剂量葡萄糖可诱导人视网膜毛细血管内皮细胞凋亡,这有可能是促进糖尿病性视网膜病发展的原因。
- 马建芳杨中汉宋志宏郭颖蔡卫斌刘倩平郭琳琅高国全
- 关键词：视网膜病糖尿病性细胞凋亡高血糖症流式细胞计数
- 质量控制工具在临床生化项目过程能力验证中的应用被引量：3
- 2013年
- 目的:运用质量控制工具,验证本实验室的过程能力,设计最佳的室内质量控制规则.方法:参考美国临床实验室改进法案(CLIA’88)中的分析质量要求,作为临床允许总误差(total allowed error,TEa),结合本实验室的室内质控变异系数(CV%)作为分析方法的不精密度,生化室间质评的偏倚(Bias%)作为分析方法的不准确度,以方法决定图反映检测方法的过程稳定性,用Westgard质控选择表格确定候选方法,以功效函数图和操作过程规范图确定最佳的质控方案.结果:各项目据其分析方法性能特征选择最佳质控规则进行室内质量控制.结论:实验室运用质量控制工具,确定质控方案,查找本实验室存在问题,开展全面质量控制策略(TQC),保证临床实验室的质量要求.
- 刘远兴吴新伟李建杰杨霞侯海松
- 关键词：临床生化
- 长链非编码RNA HOTAIR在肝肿瘤中的研究进展被引量：2
- 2015年
- 长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200nt的RNA分子,在多种层面上(如表观遗传学,转录调控,转录后调控等多种层面上)调控基因表达,而且与肿瘤细胞的增殖,侵袭,凋亡密切相关,参与肿瘤的转移。HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR),是第一个被发现的具有反式调控作用且远距离调控2号染色体上的HOXD基因簇的lncRNA。HOTAIR作为组蛋白修饰复合物的支架,5'端结构域结合多梳抑制复合体2(PRC2),3'端结构域结合组蛋白去甲基化酶复合体[赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(LSD1)/RE1-沉默转录因子(REST)共阻抑蛋白(Co REST)/REST],并介导这两种复合体至特定基因位点,分别使染色体组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)和组蛋白H3第4位赖氨酸去二甲基化(H3K4me2),从而使长达40kb的碱基(包括HOXD8,HOXD9,HOXD10,HOXD11以及一些nc RNA)发生表观遗传学沉默。肿瘤细胞中高表达HOTAIR能抑制抑癌基因的表达,促进肿瘤复发和转移,而下调HOTAIR表达则降低肿瘤细胞的转移侵袭能力。体外实验还发现下调HOTAIR表达具有增加肝肿瘤细胞对化疗药物敏感性的功能。
- 莫晓聪林燕娴季钰尧刘驰裕杨平珊杨霞
- 关键词：肝肿瘤
- 野生型stathmin 1及其C末端突变体的功能研究被引量：1
- 2009年
- 目的:研究stathmin1过表达对黑色素细胞的生长和功能的作用;探讨C末端7个氨基酸残基的突变对stathmin1生物功能的影响。方法:构建stathmin1克隆载体及其C末端定点突变载体。转染载体到黑色素细胞中,MTT、流式细胞仪、分光光度法等研究野生型以及突变型stathmin1对于黑色素细胞生长以及细胞特异性功能的影响。结果:成功构建含有野生型stathmin1的克隆载体pAdTrack-stathmin1及其定点突变载体pAdTrack-stathmin 1-mut;MTT法和流式细胞仪检测到突变型和野生型stathmin 1都能有效抑制黑色素细胞生长、诱导细胞凋亡;分光光度法检测黑色素细胞特异性功能黑色素产量以及酪氨酸酶活性因stathmin 1的转染而受到明显影响。结论:Stathmin 1稳定表达对于黑色素细胞的生长有重要意义,高表达可以抑制细胞生长以及细胞特异性功能,C末端模序结构的破坏并不能影响stathmin 1的生物学功能。
- 张彦熊建军王嘉励杨光朱振宇
- 关键词：STATHMIN定点突变黑素细胞
