云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室
- 作品数：381 被引量：887H指数：13
- 相关作者：宋建领李华春王静林赵文华杨仕标更多>>
- 相关机构：云南农业大学成都军区疾病预防控制中心云南省动物疫病预防控制中心更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金公益性行业(农业)科研专项云南省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>
- 鹅副粘病毒F基因的克隆测序及核苷酸序列分析被引量：28
- 2002年
- 以鹅副粘病毒 (GPV) SF0 2株的基因组 RNA为模板 ,通过 RT- PCR的方法扩增出 F基因片段 ,然后将其克隆至 T载体中。经 PCR鉴定后 ,对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出 F基因的全序列。与 Gen Bank下载的 9株参考毒株比较 F基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测 GPV- SF0 2毒株与参考毒株 L Z- NDV核苷酸序列同源性为 96 %,与F48E9同源性为 92 .5 %,与 L a Sota为 88%。
- 赵文华朱建波姚龙涛宋建领信爱国何水林张念祖
- 关键词：核苷酸序列分析鹅副粘病毒F基因基因克隆
- 2013年云南省禽流感H9N2亚型病毒神经氨酸酶基因序列分析被引量：1
- 2015年
- 目的了解2013年云南省禽流感H9N2亚型病毒NA基因变异及进化特征。方法对2013年云南省禽流感H9N2监测阳性样品进行NA基因克隆、测序及系统发育分析。结果 2013年云南省禽流感H9N2亚型病毒株NA基因核苷酸序列同源性为84.5%-99.5%,属于欧亚分支的类ADKHKY28097分支和类ACKHKG997分支。类ADKHKY28097分支为目前云南优势分支,且又进一步划分为Ⅰ-1、Ⅰ-2小分支。氨基酸比对分析表明,2013年云南毒株NA蛋白402位糖基化位点存在显著变化,161位新增了一个糖基化位点;唾液酸结合位点、抗原位点存在显著变异;酶活性位点稳定。除上述关键性氨基酸位点外,其余位点与现用疫苗株、参考毒株相比存在显著差异;且Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅱ分支毒株多个位点存在各自特有的氨基酸替代,这种替代具有一定的进化（亚）分支特异性。结论 2013年云南省H9N2亚型禽流感病毒间具有遗传差异,类ADKHKY28097分支已成为当地流行的优势毒株,NA蛋白存在特异性氨基酸变异位点。
- 胡媛媛张文东宋建领张应国赵焕云张富强
- 关键词：禽流感病毒H9N2亚型神经氨酸酶
- 帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备被引量：1
- 2021年
- 本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。
- 李占鸿宋子昂杨振兴肖雷李卓然谢佳芮李华春杨恒
- 关键词：VP7蛋白原核表达多克隆抗体
- 化脓隐秘杆菌可视化LAMP检测方法的建立
- 2023年
- 为建立化脓隐秘杆菌(A.pyogenes)可视化LAMP检测方法,本研究根据A.pyogenes 16S rRNA基因的特异性保守核苷酸序列设计两对LAMP引物,通过反应体系和反应条件的优化,结果显示,本研究建立的LAMP方法的最佳反应条件为62℃反应70 min。利用建立的LAMP方法检测金黄色葡萄球菌、伪结核棒状杆菌、A.pyogenes等山羊和绵羊常见的16种细菌的DNA样品,结果显示仅A.pyogenes DNA样品检测为阳性,其它细菌DNA样品和阴性对照检测均为阴性,表明该方法具有较强的特异性。利用建立的LAMP方法检测不同稀释度的重组质粒标准品pMD19T-Arc,结果显示检测限为8.2拷贝/μL,表明该方法具有较高的敏感性。利用建立的LAMP方法和普通PCR方法对128份山羊和绵羊皮下脓肿样品进行检测,结果显示两种方法对A.pyogenes的阳性检出率分别为18.8%(24/128)和17.2%(22/128),总符合率为98.4%(126/128)。结果表明,本研究首次建立了检测A.pyogenes的基于钙黄绿素指示剂的可视化LAMP方法,为山羊和绵羊A.pyogenes感染的检测提供了一种可视化快速的技术手段。
- 李富祥朱沛赵文华宋建领高华峰
- 关键词：化脓隐秘杆菌
- 登革病毒及其所致疾病的研究概况被引量：3
- 2005年
- 登革病毒所致疾病包括登革热、登革出血热及登革休克综合征,是全球分布最广、发病最多的一种虫媒传染病,近年发病呈上升趋势,严重威胁人类健康。文章概述了登革热病原学、流行病学、发病机制、临床表现、诊断进展、治疗、预防和控制等。
- 廖德芳
- 关键词：登革病毒登革热登革出血热登革休克综合征传染病
- 化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立被引量：4
- 2021年
- 为建立化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)和溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)快速核酸检测方法,本研究根据化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA保守序列设计2对特异性引物及2条TaqMan探针。经对反应体系和反应条件进行优化,建立了化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性结果显示,该方法与金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、肠炎沙门菌和大肠杆菌等22种常见细菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌质粒标准品的最低检出浓度分别为31 copies/μL和65 copies/μL,且变异系数小于3%。对45份临床肺样品的检测结果显示,化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为15.5%和24.4%。本研究建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的检测提供了敏感、快速的方法。
- 李富祥高华峰赵文华邵庆勇洪琼花杨仕标
- 关键词：化脓隐秘杆菌
- 云南省墨江县库蠓中一株西藏环状病毒的分离及全基因组序列分析被引量：1
- 2022年
- 西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)于2009年首次从中国西藏自治区采集的圆斑按蚊中分离出,目前在中国的云南省、广东省、湖南省和临国日本均有分离报道。2017年我们从云南省墨江县采集的库蠓样品中分离到一株病毒(MJC1-7),接种BHK-21和C6/36细胞后均可产生聚集、皱缩和脱落等明显细胞病变。1%的琼脂糖凝胶电泳显示,病毒基因组为十节段的双链RNA,呈现“3-3-3-1”的带型。通过病毒全长cDNA扩增和测序获取MJC1-7毒株的全基因组核苷酸序列,病毒基因组全长为19260 bp(包括编码区18495 bp和非编码区735 bp),由Seg-1(3950 bp)至Seg-10(832 bp)的10个基因节段构成,可编码6165个氨基酸残基。对环状病毒保守的VP1(Pol)、VP3(T2)和VP7(T13)蛋白氨基酸序列及系统发育分析显示,MJC1-7毒株与TIBOV亲缘关系最近,氨基酸序列相似度为95.4%~99.7%。对决定环状病毒血清型VP2(OC1)蛋白氨基酸序列与系统发育分析显示,MJC1-7与云南(SX-2017a、DH13C120和YN15-283-01)和广东(D181/2008)分离的TIBOV毒株聚为一簇,氨基酸序列相似度为97.3%~98.6%,而中国西藏毒株(XZ0906)和日本毒株(KSB-8/C/09和KSB-3/C/10)形成了另外3个独立的进化分支,MJC1-7与其相似度仅为27.8%~41.8%,以上结果表明MJC1-7毒株与云南和广东毒株有更近的亲缘关系,而中国西藏和日本毒株可能为Seg-2(OC1)基因变异较大毒株。本研究报道了一株TIBOV在我国云南省墨江县库蠓上的分离以及全基因组序列分析,研究结果进一步丰富了我们对TIBOV的认知,为深入研究我国TIBOV的分布、致病性与病原学检测技术提供了基础数据。
- 杨振兴孟锦昕何于雯李楠王静林
- 关键词：库蠓病毒分离
- 羊口疮病毒及山羊痘病毒双重PCR检测方法的建立被引量：2
- 2017年
- 为实现山羊两种疫病病原体——羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于ORFV的025基因及GTPV的ITR基因,分别设计用于普通双重PCR的引物两对、用于双重实时荧光定量PCR的特异性引物及探针两套。试验结果显示,所建立的ORFV-025/GTPV-ITR-S双重普通PCR方法,可实现对GTPV与ORFV的特异性双重检测,检测敏感度可达104拷贝/μL DNA;所建立的025-ITR二联探针实时荧光定量PCR方法亦可同时特异性检测ORFV和GTPV产生特异性荧光信号,二联探针的检测敏感度可分别达102.71拷贝/μL和102.88拷贝/μL DNA。本研究初步建立了可同步快速特异性检测ORFV和GTPV的双重普通PCR及二联实时荧光定量PCR检测方法。
- 赵文华杨仕标姚俊李富祥
- 关键词：羊口疮病毒山羊痘病毒实时荧光定量PCR探针
- 云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析被引量：2
- 2021年
- 2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型(BTV-7)毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BTV-7型毒株并掌握其遗传特征。作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、BHK-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细胞上的感染特性,采用高通量测序获取分离毒株的全基因组序列,通过qRT-PCR与血清中和试验对哨兵牛血液中的病毒核酸与中和抗体变化进行回溯分析。结果表明:2020年5月,分离到1株能引起BHK-21细胞发生细胞病变的病毒(毒株号V303/YNJH/2020),经鉴定为BTV-7型。分离毒株的基因组全长19154 bp(GenBank收录号MW046280至MW046289),与广东省2014年分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,基因节段1至6,基因节段9与10的核酸与编码蛋白氨基酸序列(nt/aa)相似度分别大于98%、99%;V303/YNJH/2020毒株的基因的节段7和基因节段8属Western地域型,与广东GDST008毒株对应基因节段的nt/aa序列相似度仅为71.5%/81.6%、79.6/%84.4%。病毒蚀斑与增殖曲线比较显示,V303/YNJH/2020在BHK-21细胞的增殖能力明显强于GDST008。回溯分析显示,感染V303/YNJH/2020的哨兵牛未出现临床症状,血液中的病毒核酸持续存在长达12周;在病毒感染后第4~9周,血液中的中和抗体滴度水平维持在1∶256。云南省2020年分离的BTV-7型V303/YNJH/2020毒株与广东省分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,在BHK-21细胞上的增殖能力强于GDST008毒株;V303/YNJH/2020虽未引起感染动物的临床症状,但病毒核酸与中和抗体在感染动物血液中长时间存在。研究结果为开展BTV-7型在我国的演化规律、病毒变异以及致病性等方面的研究奠定了基础。
- 李占鸿宋子昂廖德芳杨振兴谢佳芮高翔胡忠燕李卓然李华春杨恒
- 关键词：蓝舌病病毒全基因组测序基因重配
- 2020年云南省边境地区牛蓝舌病血清学调查被引量：3
- 2022年
- 为了解蓝舌病(bluetongue,BT)在云南边境地区的流行和分布情况,2020年采用竞争ELISA方法,在云南省边境地区12个县市随机采集135个养殖场、活畜交易市场和散养户的3800份牛血清样品进行蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)抗体检测。结果显示:12个边境县市均检出阳性血清样品,平均样品阳性率为77.9%,场户阳性率为93.3%;样品阳性率有一定的地区差异,其中陇川县最高(92.0%),孟连县最低(48.0%),差异存在统计学意义(P<0.05);境外牛血清样品阳性率(84.8%)显著高于本地牛(67.9%),P<0.05;不同饲养方式下的样品阳性率存在差异,其中舍饲最高(81.4%),半放牧半舍饲(62.5%)最低,P<0.05;黄牛样品阳性率(80.0%)明显高于水牛(61.4%),P<0.05。结果推断,BT在云南边境地区可能广泛存在且流行严重,需要持续开展血清学调查、监测,重点加强对境外牛的控制。本研究为我国西南边境地区BT防控提供了数据参考。
- 寇美玲杨佳萍谢佳芮苗海生
- 关键词：蓝舌病边境地区竞争ELISA阳性率
