国家自然科学基金(31172320)
- 作品数：2 被引量：12H指数：2
- 相关作者：马立新余晓岚陈亮严红钟星更多>>
- 相关机构：湖北大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金全球变化研究国家重大科学研究计划湖北省教育厅青年基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 构建定向T载体用于基因克隆和表达被引量：10
- 2013年
- 传统的T载体克隆方法需要烦琐的后续步骤来筛选和鉴定重组子,并且无法实现目的基因的定向克隆。为了克服这些问题,本研究在pET-23a(+)的基础上构建了定向T载体pETG,首先通过定点诱变消除pET-23a(+)上的两个BfuⅠ位点得到PET-23aM;设计一对引物在5端各引入一个BfuⅠ位点,下游引物紧邻BfuⅠ位点引入13 bp的部分LacO序列,用该引物从pHBM2002上扩增Prrn-gfp表达盒,插入PET-23aM的NdeⅠ和XhoⅠ位点,得到定向T载体pETG。PCR扩增的目的基因通过下游引物引入7 bp剩余的LacO序列,该基因片段与BfuⅠ酶切制备的定向T载体连接、转化大肠杆菌DH10β感受态细胞,通过补加了X-gal的平板筛选蓝色重组子。质粒酶切和PCR鉴定表明蓝色菌落全部为定向插入的重组子,重组效率100%,利用本方法成功地定向克隆了103个人类肝蛋白编码基因cDNA,克隆过程无需复杂的步骤筛选鉴定重组子。随机选择了其中的8个基因的克隆进行表达,结果显示8个克隆均在大肠杆菌中获得成功表达。该结果表明定向T载体构建成功,并且该载体非常适合基因的克隆和表达。
- 钟星翟超陈亮余晓岚蒋思婧严红杨登想马立新
- 关键词：TA克隆PCR克隆蛋白质表达
- 融合胸腺素α1的猪干扰素α在毕赤酵母中的表达及效价测定被引量：2
- 2017年
- 猪干扰素α(IFN-α)是在特定条件下由细胞产生的一种具有广谱、高效抗病毒活性的可溶性糖蛋白,胸腺素α1(Tα1)是一种具有免疫调节的活性肽.本研究中将Tα1基因与去掉信号肽序列的猪IFN-αN端融合,构建酵母表达载体PHBM-Tα1-IFNα,同时构建单独表达IFNα的重组质粒PHBM-IFNα,重组质粒电转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株,甲醛诱导表达.利用SDS-PAGE法检测融合蛋白的表达,并用细胞病变抑制法测定干扰素的效价.实验结果表明,酵母表达上清中IFNα的效价为2.916×10~6U/m L;Tα1-IFNα的效价为2.860×10~7U/m L,该结果证实胸腺素α1可提高融合表达蛋白猪干扰素的活性,因此,通过酵母表达体系获得高活性胸腺素-猪干扰素融合蛋白,可为高效、低成本获得抗病毒药物提供一种新的模式.
- 刘敏张晨瑶王飞翟彦生肖颖马立新余晓岚
- 关键词：干扰素毕赤酵母表达系统
