辽宁省教育厅高等学校科学研究项目(20060524)
- 作品数：5 被引量：7H指数：1
- 相关作者：方伯言黄美风于国华肖楠李华更多>>
- 相关机构：辽宁医学院附属第一医院辽宁医学院航天中心医院更多>>
- 发文基金：辽宁省教育厅高等学校科学研究项目国家自然科学基金辽宁省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 靶向人NHE-1RNAi腺病毒表达载体的构建及细胞内酸化模型的建立被引量：1
- 2011年
- 目的构建靶向人钠氢交换蛋白-1(NHE-1)RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体,感染SH-SY5Y细胞,建立细胞内酸化模型,为进一步研究细胞内pH值变化与散发性阿尔茨海默病间的关系奠定基础。方法利用基因重组技术构建4个含NHE-1前体微小RNA(miRNA)的重组干扰质粒pcDNA^(TM)6.2-GW/miR和阴性对照质粒pcDNA6^(TM)6.2-GW/neg-miR,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测NHE-1 mRNA表达变化,筛选最佳干扰靶序列;BP和LR重组系统获得腺病毒干扰质粒pAd-miR-NHE-1,经包装、纯化后检测腺病毒滴度;感染复数(MOI)值梯度试验确定靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值,以最佳条件感染SH-SY5Y细胞,荧光探针法检测不同处理组细胞内pH值。结果聚合酶链反应(PCR)提示最佳靶向人NHE-1 RNAi病毒表达载体构建成功,且能有效抑制NHE-1 mRNA表达;靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值为160。当最佳MOI值为160时,NHE-1 miRNA腺病毒感染24、48和72 h后SH-SY5Y细胞内pH值分别为5.97±0.03、5.98±0.02和5.98±0.02;空载体对照组为6.05±0.04、6.04±0.07和6.03±0.05;空白对照组为6.03±0.06、6.05±0.04和6.03±0.04。不同测量时间点,SH-SY5Y细胞内pH值均显著低于空载体对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(24 h:p=0.002,0.015;48 h:p=0.030,0.012;72 h:p=0.018,0.010);但感染RNAi腺病毒后不同测量时间点(24、48和72 h)SH-SY5Y细胞内pH值差异无统计学意义(p=0.762)。结论最佳靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体及细胞内酸化模型的成功建立,可为探索细胞内酸碱平衡与β-淀粉样蛋白产生之间的关系提供一种有效工具。
- 方伯言黄美风
- 关键词：酸碱平衡腺病毒科酶链反应
- NHE-1 miRNA转染所致细胞内pH值变化对BACE1的影响
- 2012年
- 目的探讨腺病毒介导的人Na+-H+交换体-1(NHE-1)miRNA转染人源性神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)后,细胞内pH值变化及其对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)的影响。方法培养SH-SY5Y,随机分为正常对照组、NHE-1基因敲低组和阴性对照组,并构建NHE-1基因敲低细胞模型。采用荧光分光光度计测定各组细胞内pH值,通过Real-time PCR及Western blotting检测BACE1 mRNA及蛋白表达。结果与正常对照组相比,NHE-1基因敲低组细胞内pH值明显降低(P<0.01),阴性对照组细胞内pH值无明显变化;NHE-1基因敲低组细胞内BACE1 mRNA表达及蛋白含量明显增高(P<0.01),阴性对照组细胞内BACE1 mRNA表达及蛋白含量无明显变化。结论细胞内pH值降低能够增强BACE1的表达。
- 于国华方伯言
- 关键词：细胞内PH值
- 细胞内酸化对自噬的影响
- 2012年
- 目的探讨细胞内酸化对自噬的影响。方法利用pAd-miR-NHE-1病毒悬液转染人源性神经母细胞瘤细胞株,制备NHE-1基因敲低细胞模型。在透射电镜下观察阴性对照组及腺病毒转组转染成功后0.5、2、4、8 h自噬体的形成、线粒体形态及溶酶体数目的变化;Western blotting法检测自噬标记物LC3Ⅱ的表达。结果透射电镜下,阴性对照组线粒体形态及溶酶体数目正常,腺病毒转染成功后0.5～4 h可见线粒体肿胀、变形,溶酶体数目增多,自噬囊泡增多,自噬小体形成。8 h可见凋亡小体出现,线粒体数目减少,未见自噬小体,可见少量溶酶体。Western blotting显示,阴性对照组LC3Ⅱ表达较低,腺病毒转染成功后0.5 h LC3Ⅱ表达升高(P<0.01),4 h达高峰(P<0.01),8 h表达降低,且低于阴性对照组(P<0.01)。结论细胞内酸化可以激活自噬的发生。
- 肖楠方伯言
- 关键词：自噬LC3
- 人NHE-1基因miRNA干扰载体构建、鉴定及干扰效应评价被引量：6
- 2010年
- 目的构建人钠氢交换蛋白-1(NHE-1)基因的miRNA特异性干扰表达载体并转染293细胞,筛选其有效性。方法设计4对miRNA oligo,依次通过退火、连接,构建含NHE-1前体miRNA的重组干扰质粒pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR和阴性对照质粒pcDNATM 6.2-GW/neg-miR,并转染293细胞,经Re-al-Time PCR评价干扰效应,筛选出干扰效应最佳的靶序列。结果测序证实目的片段正确插入载体中,成功构建4个人NHE-1基因miRNA干扰载体;Real-Time PCR证实完成干扰效应评价,并根据NHE-1基因转录调控区及其蛋白分子结构功能区评价结果,得到NHE1-4是最佳干扰片段。结论成功构建针对人NHE-1基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续NHE-1基因腺病毒miRNA表达载体的构建及其在调控APP裂解相关酶类的功能研究奠定了基础。
- 黄美风方伯言
- 钠氢交换蛋白1在β淀粉样蛋白25-35诱导大鼠阿尔茨海默病神经元模型中的作用
- 2010年
- 目的探讨钠氢交换蛋白1(NHE1)的表达对阿尔茨海默病(AD)神经细胞凋亡的影响及对神经生长因子的保护作用。方法培养大鼠大脑皮质神经元细胞,应用β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)构建AD细胞模型,并加入神经生长因子干预,四甲基噻唑蓝比色法(MTT)测定神经细胞活力,Western印迹分析法测NHE1及Capase3表达。结果经Aβ25-35诱导的AD细胞模型NHE1表达抑制,神经生长因子可通过激活NHE1表达有效增强神经细胞活力(P<0.01)、抑制Capase3表达(P<0.01)、抑制神经元细胞凋亡。结论NHE1表达抑制在AD神经元凋亡中发挥重要作用,NHE1表达增强可有效抑制细胞凋亡。
- 李华方伯言
- 关键词：阿尔茨海默病钠氢交换蛋白细胞凋亡
