国家自然科学基金(30400160)
- 作品数：10 被引量：23H指数：3
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- BALB／c小鼠精原干细胞长期培养和移植的实验研究
- 2009年
- 目的建立小鼠精原干细胞（SSC）长期培养体系，探讨SSC体外增殖分化的关键因子。方法收集出生4～6d BALB／c绿色荧光小鼠睾丸，采用改良两步消化法获得细胞悬液，3次差速贴壁去除体细胞获得富集的精原细胞，采用添加生长因子的无血清基础培养液重悬，种植到小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。基础培养液为StemPro-34SFM干细胞培养基并补充15种添加成分；生长因子为10ng／ml碱性成纤维细胞因子、20ng／m[胶质细胞源性神经营养因子和200ng／ml GDNF家族受体α1。取4～5周龄BALB／c雄性小鼠15只，腹腔注射40mg／kg的白消安建立受体模型，采用三维显微注射系统将培养的SSC移植到受体左侧睾丸精曲小管内，右侧睾丸作为自身对照；分别采用体视荧光显微镜观察和HE染色检测细胞移植后睾丸生精功能恢复情况。结果改良消化富集法消化后细胞活性〉98％，SSC富集约18．5倍。饲养层培养1～2d后细胞成对称或线形排列，细胞间可见明显的胞质桥连接。3～4d后精原细胞增殖形成典型的克隆，为边缘不清楚的团块；小鼠SSC能在该培养体系中稳定培养、传代3个月。移植后2个月，体视荧光显微镜下受体睾丸内可见明显绿色阳性克隆，HE染色证实移植的SSC在受体睾丸内克隆增殖并分化产生成熟的精子。结论成功建立了BALB／c小鼠SSC培养体系，为研究SSC增殖分化调控机制及SSC移植治疗男性不育提供了实验依据。
- 申复进张茨杨嗣星熊云鹤廖文彪杜贤进王玲珑
- 关键词：精原细胞干细胞细胞培养技术小鼠
- 精子再生过程中Ki-67、Thy-1和Oct4的表达及其意义
- 2009年
- 重建精子发生是研究精原干细胞（SSCs）增殖分化调控机制的一种重要手段。细胞株增殖抗原Ki-67在精原细胞中呈阳性表达。Thy-1和Oct4虽是造血干细胞、胚胎干细胞等多种干细胞的标记物，但在SSCs中的表达尚存在争议。我们在建立小鼠精子再生模型的基础上，观察不同时期生精上皮组织形态学变化以及生精细胞Ki-67、Thy-1和Oct4的表达特点。
- 罗小敏张茨杨嗣星申复进王玲珑
- 关键词：THY-1OCT4再生过程组织形态学变化精原干细胞细胞株增殖
- 输出小管-睾丸网注射提高小鼠精原干细胞移植效率被引量：5
- 2009年
- 目的:探讨小鼠精原干细胞移植的关键技术,寻求有效可行的精原干细胞移植方法。方法:选用4-5周龄雄性BALB/c小鼠45只腹腔内注射40 mg/kg的白消安建立受体模型,消化分离新生绿色荧光小鼠睾丸精原细胞作供体细胞。在三维显微注射系统下分别采用睾丸网注射法(n=15),输出小管注射法(n=30),经输出小管注射失败后的补救方式为经输出小管-睾丸网注射,将供体细胞注射到受体小鼠左侧睾丸精曲小管内,右侧睾丸作为对照。观察注射后精曲小管的充盈度和外漏的情况;移植后2个月观察受体小鼠的生精功能恢复情况。结果:经睾丸网注射成功率仅为35.7%(5/14),其中9只因睾丸网穿破、细胞悬液外漏到间质而失败。经输出小管注射成功率为72.4%(21/29),失败的主要原因为穿刺过程中穿破输出小管,进一步采用经输出小管-睾丸网注射补救,总成功率提高为93.1%(27/29),注射成功后可见70%-80%的精曲小管被蓝染的细胞悬液充盈,均无外漏现象。移植后2个月,体视荧光显微镜下可见移植侧睾丸包含多段绿色阳性克隆;组织学染色示移植侧睾丸大部分精曲小管恢复正常生精。结论:经输出小管和经输出小管-睾丸网显微注射技术是小鼠精原干细胞移植的有效方法。
- 申复进张茨王将杜贤进熊云鹤廖文彪王玲珑
- 关键词：精原干细胞小鼠
- 精原干细胞增殖和分化阶段小鼠睾丸基因的差异表达被引量：3
- 2009年
- 目的分析精原干细胞增殖和分化阶段小鼠睾丸组织基因表达谱的变化，初步探讨精原干细胞增殖和分化的调控机制。方法48只雄性昆明白小鼠采用间隔24d二次腹腔注射白消安（10mg／kg）制备小鼠精子再生模型，8只作为对照组。根据精子再生过程生精上皮的组织形态学变化以及精原细胞增殖情况选取精原干细胞处于增殖和分化阶段的睾丸组织，运用基因表达谱芯片检测2个阶段的睾丸组织基因表达差异，对差异表达基因进行生物信息学分析。结果检测到睾丸组织差异表达基因911个，上调608个（增殖期／分化期）、下调303个。差异表达基因分别涉及生物学过程、分子功能和分子组成。84个信号通路功能改变差异有统计学意义（P〈0．05），包括Notch和Wnt信号通路。与干细胞相关的差异基因有56个，上调40个、下调16个。部分干细胞的阳性标记物（如Cd9、Stra8、Itgb1、Oct4和Thy1）和部分生长因子（如Fgf2、Csf1和Pdgfa）上调。结论小鼠精原干细胞增殖和分化过程的调控涉及许多基因（分属不同信号通路）的差异表达，这些基因和通路对精原干细胞增殖的作用还有待进一步研究。
- 罗小敏张茨杨嗣星申复进王玲珑
- 关键词：精原干细胞增殖分化基因芯片
- 以α6-integrin和c-kit为特异性表面标志分离筛选小鼠精原干细胞的可行性被引量：1
- 2009年
- 背景:从目前文献报道来看,精原干细胞分离效率较高且较为公认的方法是通过隐睾模型结合表面标志进行多参数筛选。目的:探讨α6-integrin和c-kit作为分离筛选精原干细胞特异性表面标志的可行性。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-05/12在武汉大学人民医院完成。材料:6周龄雄性昆明白小鼠40只,随机分为隐睾组、正常对照组,20只/组。方法:隐睾组小鼠建立隐睾模型,麻醉后腹部正中切口,将两侧睾丸拉入腹腔,将脂肪垫靠近附睾处各缝一针,分别固定在侧腹壁。正常对照组小鼠不进行任何干预。造模后两三个月,采用传统的两步消化法获取生精上皮单细胞悬液,加入FITC标记的抗α6-integrin抗体和PE标记的抗c-kit抗体,利用流式细胞仪进行α6-integrin+和c-kit-双重筛选,锥虫蓝染色监测细胞活性。主要观察指标:隐睾的形态学变化,精原干细胞分选结果。结果:隐睾小鼠的生精小管内细胞排列紊乱,层次及管腔消失,小管中央可见分裂相细胞,细胞数明显减少。与正常对照组比较,隐睾组sidescatterlow、Forwardscatterhi区的睾丸细胞增多,图形向左上移位。α6-integrin+和c-kit-细胞分布存在明显的相互偏离,即α6-integrin+细胞绝大多数不是精原干细胞,c-kit-细胞绝大多数也不是精原干细胞。从隐睾组筛选出具有sidescatterlow、α6-integrin+、c-kit-特征的细胞数占睾丸细胞总数的2.8%,此即为精原干细胞,锥虫蓝监测结果显示细胞活性达95%以上。结论:采用α6-integrin和c-kit这两种表面标志进行精原干细胞的筛选,尽管可以提高细胞悬液中的精原干细胞纯度,但均缺乏特异性。
- 杜贤进张茨刘春霞王玲珑余小祥
- 关键词：精原干细胞细胞分选
- Ki-67、Thy-1和Oct4在小鼠生精恢复过程中的表达及其意义被引量：1
- 2009年
- 目的:探讨精子再生过程中Ki-67、Thy-1和Oct4的表达及其意义。方法:采用间隔24d2次白消安[10mg/(kg.次)]小鼠腹腔内注射建立精子再生模型,于第2次给药后第1,2,3,4,6和8周运用免疫组化检测Ki-67、Thy-1和Oct4在生精上皮表达及其表达规律。结果:形态学显示第2次给药后3周主要为精原干细胞增殖期,4周为分化期,6-8周为精子发生恢复期。Ki-67表达见于精原细胞和少量精母细胞。精原细胞Ki-67阳性率在第2次给药后3周最高,第4周明显下降,6-8周恢复至正常对照组水平。Thy-1表达于精原细胞,在精子再生各阶段阳性表达率均较高,其中,第3周表达最高,第2周次之。Oct4表达仅见于紧贴曲细精管基底膜的精原细胞,在第3周表达较对照组显著上调,第4周下降,6-8周恢复至对照组水平。精原细胞Oct4和Ki-67阳性率之间的相关系数为0.779。结论:Thy-1并非特异性表达于精原干细胞。Oct4表达上调是促进精原干细胞增殖的重要因素。
- 罗小敏张茨杨嗣星王玲珑
- 关键词：KI-67OCT4THY-1精原干细胞
- Long-term culture and transplantation of spermatogonial stem Cells from BALB/c mice
- Objective : Development of a culture system that supports self-renewal and proliferation of SSCs in vitro is e...
- Fujin Shena
- BALB/c小鼠精原干细胞体外长期培养和鉴定被引量：6
- 2008年
- 目的：建立小鼠精原干细胞长期培养体系，探讨精原干细胞体外增殖分化的关键因子。方法：收集出生4～6dBALB／c绿色荧光小鼠睾丸，采用改良的两步消化法获得细胞悬液，种植到铺有明胶的培养皿中，分别于种植后1、5、24h通过差速贴壁法去除体细胞，获得高度纯化的精原干细胞，种植到丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养。基础培养液为StemPro-34SFM干细胞培养液并补充15种添加成分；添加20ng／ml大鼠胶质细胞源神经营养因子（GDNF）、10ng／ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和200ng／mlDDNF受体α1（GFRM）促进精原干细胞增殖。分别采用免疫荧光染色和RT—PCR检测精原干细胞已知抗原和标志性基因的表达。结果：饲养层上培养3～4d后精原干细胞增殖形成典型的克隆，为边缘不清楚的团块状；小鼠精原干细胞能在该培养体系中稳定传代培养达3个月。免疫荧光共聚焦显微镜观察示Oct-4特异性表达在培养的精原干细胞核上；而GFRM显著表达在培养的精原干细胞膜表面；RT—PCR也证实培养的精原干细胞表达Oct-4、GFRal、Sox2和c—Ret等象征未分化精原细胞的标志基因。结论：BALB／c小鼠精原干细胞可在体外长期培养（3个月），该培养体系的建立将为研究精原干细胞增殖分化调控机制及精原干细胞移植治疗男性不育奠定基础。
- 申复进张茨杨嗣星熊云鹤廖文彪杜贤进王玲珑
- 关键词：精原干细胞小鼠
- 改良消化富集法提高精原干细胞富集效率的实验研究被引量：1
- 2009年
- 目的建立一种改良的小鼠精原干细胞消化富集方法，为精原干细胞体外长期培养和移植奠定基础。方法收集t20个出生4—6dBALB／c新生小鼠的睾丸，平均分为对照组和实验组，分别采用传统的两步消化法（对照组）和改良消化法（实验组）分离消化获得细胞悬液，并种植到铺有明胶的培养皿中，于种植后1h、5h、24h通过差速贴壁法去除体细胞，获得富集的精原干细胞。以Thy．1作为精原干细胞的表面标志，分别在3次差速贴壁前、后采用流式细胞仪检测Thy．1阳性细胞的比例，比较两组精原干细胞的富集效率。结果实验组和对照组消化所获得的细胞数分别为（3．4±0．5）×10^5／睾丸和（3．6±0．3）×10^5／睾丸，无统计学差异（P〉0．05）。然而，实验组细胞贴壁具有良好的活性，初次贴壁仅需40-50min，而对照组细胞需要4-5h甚至过夜培养才能贴壁。3次差速贴壁后，实验组Thy．1阳性细胞占睾丸细胞的比例为（56．3±4．7）％，而对照组仅为（32．6±4．2）％，差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论改良消化富集法能明显提高睾丸细胞活性和富集效率，可获得大量高度纯化的精原干细胞，为精原干细胞培养和移植奠定基础。
- 胡卫张茨廖文彪吴永超申复进
- 关键词：精原干细胞小鼠
- 二次白消安腹腔注射致小鼠精子再生模型的建立被引量：3
- 2009年
- 目的 建立一种小鼠精子再生模型。方法采用不同剂量白消安（单剂10mg／kg、20mg／kg和间隔24d二剂10mg／kg）小鼠腹腔注射，分别于给药后第一、二、三、四、六、八周取材，进行光镜和电镜观察。二次给药组采用免疫组化检测生精细胞Ki-67表达，TUNEL标记法检测生精细胞凋亡。结果间隔24d二剂10mg／kg白消安对生精上皮的损伤效应介于单剂10mg／kg和20mg／kg之间。第二次给药后2周，生精上皮仅基底部残留以单个型精原细胞（As型）为主精原细胞和支持细胞；第三周As型精原细胞增多；第四周分化精原细胞和精母细胞出现；6～8周出现精子发生，生精上皮结构逐步恢复正常。二次给药后1～2周生精细胞凋亡指数显著高于对照组（P〈0．01），以后逐步下降，至第六～八周恢复至对照组水平（P〉O．05）。精原细胞Ki-67阳性率在第一～二周最低，在第三周最高，第四周开始下降，第六～八周与对照组无显著差异。结论间隔24d二次白消安（10mg·kg^-1·次^-1）腹腔注射可建立小鼠精子再生模型，诱导凋亡为白消安致生精细胞损伤的重要机制。二次给药后3周主要为精原干细胞增殖期，4周为分化期，6～8周为精子发生恢复期。
- 罗小敏张茨王玲珑申复进
- 关键词：KI-67抗原精子发生
