山西省回国留学人员科研经费资助项目(2011-107)
- 作品数：7 被引量：12H指数：2
- 相关作者：邓勇志郑志发陈志强王帅陈丽更多>>
- 相关机构：山西医科大学山西医科大学第二医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 平滑肌22α启动子/增强子靶向调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路对移植血管平滑肌细胞增殖的影响被引量：2
- 2015年
- 目的 采用血管平滑肌细胞（SM）特异性SM22α启动子/平滑肌肌球重链蛋白（SMHC）增强子,构建靶向大鼠哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因的干扰RNA真核表达载体,研究其对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖及移植血管新生内膜增生的影响.方法 构建大鼠特异性SM22α真核表达载体SM22α-p/e-mTOR-短发卡RNA（shRNA）,建立大鼠颈静脉-动脉移植模型,在血管吻合完成后通过Pluronic F-127质粒缓释系统对血管内平滑肌增殖进行局部RNA干扰.实验分5组,每组20只SD大鼠.A组：对照组（25％ Pluronic F-127组）;B组：SM22α组（SM22α-p/e-mTOR-shRNA）;C组：巨细胞病毒（CMV）组（CMV-p/e-mTOR-shRNA）;D组：阴性对照组（空质粒pGenesil-10）;E组：阳性对照组;其中,B组和C组统称实验组.根据实验分组的不同,将含有50 μg shRNA质粒,或50 μg渥曼青霉素（wortmannin）凝胶,或单纯200μl 25％ Pluronic F-127凝胶均匀涂抹在移植静脉周围,分别于术后1、3、7、14 d获取移植血管.苏木素-伊红（HE）染色观察新生内膜厚度;免疫组织化学检测平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）、增殖细胞核抗原（PCNA）、磷酸化-mTOR （Ser2448）,原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测细胞凋亡,评估mTOR信号通路的变化以及平滑肌细胞的增殖.结果 术后7d各组新生内膜厚度差异有统计学意义（P＜0.05）;术后14 d,A组新生内膜较术后1d增厚12.4倍;B、C、D、E组分别增厚9.7、4.8、7.6、2.6倍.术后14d,各实验组和阳性对照组移植静脉α-SM-actin表达阳性面积均明显低于对照组（P＜0.05）,PCNA阳性表达面积均低于对照组（P＜0.05）,磷酸化-mTOR（Ser2448）阳性表达面积均低于对照组（P＜0.05）;实验组、对照组、阴性对照组术后移植静脉凋亡细胞阳性面积比较差异无统计学意义（P＞0.05）,阳性对照组凋亡面积明显高于其他组（P＜0.05）.结论 SM22α-p/e-mTOR-shRNA可通过抑制血管
- 陈志强王帅邓勇志郑志发
- 关键词：新生内膜增生哺乳动物雷帕霉素靶蛋白血管平滑肌细胞
- KDR启动子／增强子靶向干扰磷脂酰肌醇3激酶信号通路对大鼠血管内皮细胞增殖和凋亡的影响被引量：1
- 2012年
- 目的针对大鼠血管内皮细胞（VEC）的磷脂酰肌醇3激酶p亚单位（Pik3cb），构建KDR特异性启动子／增强子真核表达载体，观察其对VEC增殖和凋亡的影响。方法构建KDR特异性启动子／增强子真核表达载体并转染大鼠VEC。实验分5组，A组：正常VEC；B组：转染特异性KDR质粒，浓度2．0mg／L；C组：转染非特异性巨细胞病毒（CMV）质粒，浓度2．0mg／L；D组：转染空质粒，浓度2．0mg／L；E组：阳性对照渥曼青霉素，浓度50nmol／L。分别于转染24、48、72h后，实时荧光定量逆转录．聚合酶链反应（RT．qPCR）法检测各组细胞Pik3cbmRNA相对表达量，细胞计数试剂盒（CCK_8）和流式细胞仪检测各组细胞增殖抑制率和凋亡率。结果转染24、48、72h后，RT—qPCR法测得KDR组Pik3cbmRNA相对表达量分别为（54．82±2．77）％、（50．54±3．98）％和（35．47±4．83）％，均明显低于正常对照组（P〈0．05）；CCK_8法测得KDR组细胞增殖抑制率分别为（21．98±2．25）％、（24．32±3．04）％和（26．38±5．06）％；流式细胞仪测得KDR组细胞凋亡率分别为（9．9±1．3）％、（31．0±7．4）％和（44．5±8．3）％，细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于正常对照组（P〈0．05）。结论KDR特异性启动子／增强子真核表达载体可通过下调磷脂酰肌醇3激酶（P13K）信号通路特异性抑制VEC增殖并促使其凋亡。
- 王倩邓勇志徐俊文陈丽杨雪峰
- 关键词：RNA干扰血管内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶
- 靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定被引量：1
- 2013年
- 目的构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)基因的短发卡干扰RNA(shorthair-pinRNA,shRNA)表达载体,研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用,探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段。方法根据Genbank中大鼠PI3Kp110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10,经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板;合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列,将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cb-shRNA上,构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22αp-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA(简称SM22αe/pshRNA)和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA(简称KDRe/pshRNA);将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞,分别于转染24h、48h、72h后,采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量。结果荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较,前者细胞Pik3cbmRNA相对表达量降低更为明显,且两组均较对照组mRNA表达明显减少(P<0.05);酶切鉴定重组质粒载体SM22αe/pshRNA和KDRe/pshRNA构建成功;质粒转染细胞后,Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22αe/p质粒组较阴性对照组均有所降低,且转染24h后,SM22αe/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板,能够成功构建SM22αe/pshRNA和KDRe/pshRNA质粒载体,且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达。
- 陈丽邓勇志徐俊文王倩杨雪峰
- 关键词：1-磷脂酰肌醇3-激酶SHRNA启动子
- SM22α启动子／增强子基因调控磷酸肌醇3激酶信号通路对移植血管新生内膜增生的影响被引量：1
- 2013年
- 目的采用组织特异性启动子SM22α，构建靶向大鼠磷脂酰肌醇3激酶β亚单位（Pik3cb）的短发仁RNA（shRNA）真核表达载体，观察其对静脉移植血管血栓形成和新生内膜增生的影响。方法建立大鼠颈静脉-动脉移植模型，通过Pluronic F-127质粒缓释系统在血管吻合完成后局部喷涂凝胶进行RNA干扰。实验分4组，每组30只SD大鼠，A组：对照组，空白Pluronic F-127凝胶；B组：SM22a组，含特异性SM22a启动子质粒的凝胶；C组：巨细胞病毒（CMV）组，含非特异性CMV启动子质粒的凝胶；D组：Wortmannin阳性对照组。分别于术后1、3、7、14、28d截取移植血管，苏木素-伊红（HE）染色观察新生内膜厚度；免疫组织化学检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR，Ser2448），原位末端转移酶标记技术（TUNEL）检测细胞凋亡。另设一平行实验组（12只SD大鼠），按上述方法分为4组，于术后3d取材，实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（VQ—PCR）测定Pik3cb mRNA的相对表达量。结果大体观察移植血管通畅率B组最高（86．7％），与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）；Pik3cb mRNA相对表达量B、C、D组分别下降了73．3％、81．2％、68．4％，与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）；术后1、3、7、14、28d，B组与A组比较，磷酸化mTOR（Ser2448）阳性面积均显著降低，细胞凋亡阳性面积均显著增加，差异均有统计学意义（P〈0．05），术后7、14、28d，B组与A组比较，血管内膜厚度显著降低，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论SM22α特异性启动子／增强子真核表达载体可通过下调血管平滑肌细胞磷酸肌醇3激酶-蛋白激酶B—mTOR（P13K—Akt—mTOR）信号通路而抑制其向内膜增殖、迁移，促进其凋亡，防止血管新生内膜增生，提高移植血管通畅率。
- 徐俊文邓勇志王倩陈丽杨雪峰
- 关键词：新生内膜增生磷脂酰肌醇3激酶
- 血管移植后平滑肌细胞增殖的研究进展被引量：2
- 2013年
- 冠状动脉旁路移植术（CABG）是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的有效方法之一。自体静脉是移植血管的主要来源，但移植后其远期通畅率较低且即使通畅的血管也常有病变；
- 郑志发邓勇志
- 关键词：移植血管平滑肌细胞增殖移植后冠状动脉旁路移植术自体静脉通畅率
- mTOR信号通路与心血管疾病的研究进展被引量：5
- 2013年
- 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路调节细胞的生长、代谢、增殖等过程，在细胞生长过程中扮演着重要的角色。在分化成熟的血管内皮细胞和心肌细胞中,mTOR在依赖于激活蛋白激酶B（Akt）引起的氧化应激条件下，调控细胞的凋亡和自噬过程。
- 陈志强邓勇志
- 关键词：信号通路心血管疾病MTOR雷帕霉素靶蛋白血管内皮细胞心肌细胞
- 平滑肌22α特异性启动子/增强子基因调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路对血管平滑细胞增殖和凋亡的影响
- 2014年
- 在静脉桥血管冠脉旁路移植术后,由于血管内皮损伤、管腔血流机械应力和氧气浓度增大等一系列因素的改变,导致局部损伤的血管分泌各种细胞因子作用于损伤或移植血管处,激活多种信号通路,使血管平滑肌细胞（VSMC）由分化状态（收缩型）转化为去分化状态（合成型）后反应性过度增殖、迁移,导致管腔重塑、狭窄[1].我们采用VSMC的特异性平滑肌22α（SM22α）启动子/增强子嵌合体,构建靶向大鼠VSMC哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因的干扰RNA真核表达载体,通过脂质体转染,观察其对VSMC增殖和凋亡的影响.
- 郑志发邓勇志
- 关键词：雷帕霉素靶蛋白特异性启动子信号通路基因调控增强子
