国家自然科学基金(81100852)
- 作品数：14 被引量：23H指数：3
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- 大鼠CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表达载体构建及蛋白表达
- 2022年
- 构建CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表达载体,转化于大肠杆菌BL-21细胞,并诱导蛋白的表达。以全长nNOS-pME18S重组体为模板,采用PCR扩增目的基因,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1;将重组成功的重组子CaM(nNOS)-pGEX-4T-1转化入BL-21细胞,加入诱导剂IPTG诱导CaM(nNOS)蛋白的表达,用SDS-PAGE及免疫印迹方法鉴定CaM(nNOS)的表达。CaM(nNOS)-pGEX-4T-1表达载体成功构建。在诱导温度为16℃,IPTG为0.5mmol/L条件下,诱导时间为20h,可在大肠杆菌中大量表达CaM。重组CaM(nNOS)-pGEX-4T-1原核表达载体成功构建,蛋白表达成功。
- 孟利杜彩萍
- 关键词：原核表达载体神经型一氧化氮合酶
- SUMO化修饰在缺血性脑损伤中的作用
- 2020年
- 脑卒中是一种急性脑血管疾病,主要由于脑血管破裂或血管堵塞导致血流无法供应大脑,引起脑实质损伤。脑缺血可引起多种蛋白质翻译后修饰的改变,如磷酸化、泛素化、甲基化、乙酰化和类泛素样修饰等,这些修饰在病理生理过程中起重要作用,参与脑缺血诱导的神经损伤。SUMO化(SUMOylation)为靶蛋白与小泛素样修饰物SUMO蛋白——小泛素样相关修饰分子(small ubiquitin-related modifier)共价结合,参与转录调控、细胞信号转导等多种细胞功能调控。靶蛋白的异常SUMO化通常与癌症、心脏病、糖尿病、关节炎、退行性疾病和中风等疾病相关。其中,SUMO化稳态失衡与缺血性脑损伤密切相关。本文总结了SUMO化修饰在缺血性脑损伤中作用的相关研究进展。
- 胡露露杜彩萍
- 关键词：靶蛋白神经保护神经损伤
- 基于AMPK/eNOS/NF-κB信号通路探讨虾青素对脑梗死大鼠的影响及作用机制被引量：5
- 2018年
- 目的基于AMPK/eNOS/NF-κB信号通路探讨虾青素对脑梗死大鼠的影响及作用机制。方法采用改良的Longa法建立脑梗死大鼠模型,取50只造模成功的SD雄性大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、虾青素低、中、高剂量组,每组10只,另外未造模的10只作为空白对照组。空白对照组与模型对照组均给予等体积生理盐水,阳性对照组给予20mg/(kg·d)尼莫地平,虾青素低、中、高剂量组分别给予10、20、30mg/(kg·d)虾青素,连续给药14天。检测大鼠神经功能变化;氯化三苯基四氮唑染色法检测脑梗死面积;酶联免疫吸附法检测白细胞介素10(IL-10)、IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;TUNEL法检测脑皮质缺血半影区的细胞凋亡情况;反转录-聚合酶链反应检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、核因子κB(NF-κB)mRNA表达水平;Westernblot检测p-AMPK、AMPK、p-eNOS、eNOS、NF-κB蛋白表达。结果虾青素可明显改善脑梗死大鼠的神经功能及脑梗死面积(P<0.01);抑制促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达,促进抗炎因子IL-10表达(P<0.05);降低皮质缺血半影区细胞凋亡率(P<0.01);下调NF-κB mRNA和蛋白表达,促进AMPK和eNOS磷酸化(P<0.05),但AMPK、eNOSmRNA和蛋白表达无显著差异(P>0.05)。结论虾青素能明显改善脑梗死大鼠神经功能、脑梗死面积、皮质缺血半影区细胞凋亡率及血清细胞因子,其作用机制可能与AMPK/eNOS/NF-κB信号通路密切相关。
- 吴杰杜彩萍
- 关键词：虾青素脑梗死
- 大鼠PIAS3蛋白表达、纯化及生物信息学分析
- 2022年
- [目的]构建大鼠His-PIAS3真核表达载体,将His-PIAS3于体外进行表达纯化,并对PIAS3进行生物信息学分析。[方法]采用分子克隆构建His-PIAS3-pcDNA3.1真核表达载体,之后转染入HEK293细胞进行表达,考马斯亮蓝染色检测整体蛋白变化,免疫印迹鉴定His-PIAS3蛋白表达及细胞整体蛋白SUMO化,镍柱纯化His-PIAS3蛋白。生物信息学方法分析大鼠PIAS3蛋白的理化性质、亲疏水性、二级结构及序列的保守性。[结果]His-PIAS3目的基因扩增成功,且亚克隆入pcDNA3.1载体;和空载体组相比,转染His-PIAS3-pcDNA3.1组PIAS3蛋白表达水平明显增加,且整体蛋白的SUMO化水平显著升高;镍柱纯化可获得较高纯度的His-PIAS3蛋白。生物信息学结果显示,大鼠PIAS3蛋白包含628个氨基酸残基,分子量为68.3 kDa,理论等电点为8.05,亲水性平均值为-0.242;PIAS3主要定位于膜内;PIAS3蛋白的二级结构主要由18.79%α-螺旋、13.69%延伸链和67.52%无规卷曲组成;不同物种间pias3序列相似性均在70%以上。[结论]His-PIAS3真核表达载体构建成功;His-PIAS3可在HEK293细胞中高效表达,具有较高酶活性;获得较高纯度His-PIAS3蛋白;PIAS3主要定位于核内,为碱性、亲水性不稳定蛋白,具有高度保守性。
- 孟利杜彩萍
- 关键词：蛋白纯化生物信息分析
- 活化型及失活型n-Src真核表达载体的构建及活性鉴定
- 2014年
- 目的 构建神经型酪氨酸蛋白激酶n-Src的活化型（aSrc,SrcY535F）及失活型（iSrc,SrcK303R）真核表达载体并鉴定其在HEK293T细胞中的表达及活性.方法 以野生型pRc/CMV-n-Src真核表达载体为模板,采用PCR定点突变技术分别扩增活化型及失活型pRc/CMV-n-Src全长序列,并转染入HEK293T细胞,通过免疫印迹检测n-Src的蛋白表达及其自身磷酸化水平.结果 aSrc及iSrc目的 基因成功扩增,且测序结果与预期结果一致.免疫印迹分析显示,aSrc及iSrc均能在HEK293T细胞中表达,aSrc自身磷酸化水平显著升高.结论 成功构建活化型及失活型n-Src真核表达载体,并能于HEK293T细胞中高效表达.
- 杜彩萍侯筱宇
- 关键词：真核表达载体
- 核酸染色剂SYBR-Gold染色特性分析
- 2015年
- 目的检测SYBR-Gold前染色与后染色的优缺点。方法采用前染色、后染色的方法使用SYBR-Gold对双链DNA进行染色检测,EB染色作为参照,琼脂糖凝胶电泳为检测手段,凝胶成像系统拍照观察。结果SYBRGold其前染色与后染色对于双链DNA检测能力均强于EB染色,但是SYBR-Gold预混凝胶前染色其分辨效果及DNA迁移速度受到DNA浓度的影响;SYBR-Gold预混样品的前染色方式对于目的基因的判读误差较大。结论 SYBR-Gold不适合预混样品前染色,DNA样品浓度过大(大于250ng)不适合预混凝胶前染色,SYBR-Gold后染色是理想的染色方式。
- 金磊
- 关键词：溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳
- Akt1K64/276与SUMO1结合激活ERK1/2-Elk1-BDNF信号通路被引量：3
- 2022年
- 本研究主要从蛋白质结构分析Akt1 SUMO化的位点及位点的突变对其结构与功能的影响。采用多种软件分析Akt1 SUMO化位点和Akt1野生型(Akt1wt)及Akt1K64/276R的理化性质、亲/疏水性及二/三级结构;分析结果显示,Akt1K64/276R较Akt1wt,亲/疏水性未改变,α-螺旋和β-折叠都有少量的不同。三级结构分析显示,与野生型组相比,Akt1K64R氢键增多。以Myc-Akt1wt-pcDNA3.1为模板,采用PCR定点突变技术扩增出Myc-Akt1K64/276R。DNA序列分析结果显示,Myc-Akt1K64/276R基因序列编码赖氨酸(K)的密码子AAG被成功突变为精氨酸(R)密码子AGG。免疫沉淀和免疫印迹结果显示,不共转PIAS3,Akt1也能与SUMO1结合;Myc-Akt1wt和Myc-Akt1K64/276R均可在HEK293细胞中高效表达;转染Myc-Akt1K64/276R组SUMO化水平降低了70%左右(P<0.05)。免疫印迹结果显示,在小鼠海马神经细胞HT22中,Myc-Akt1wt组ERK1/2磷酸化水平及BDNF蛋白水平是突变组的约1.5倍(P<0.05);野生型组p-Elk1是突变体组的2倍(P<0.05),而mTOR、P70S6K、4E-BP1的表达及磷酸化均无显著改变。以上结果表明,Akt1中K64/276的突变对蛋白质结构和表达未见影响,仅引起Akt1 SUMO化降低及下游ERK1/2-Elk1-BDNF信号通路的抑制。
- 孟利杜彩萍
- 关键词：生物信息学分析信号通路
- 大鼠His-Akt1重组蛋白的真核表达、蛋白纯化及活性鉴定被引量：5
- 2020年
- 构建His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体,于HEK293细胞进行表达,Ni-NTA亲和纯化His-Akt1,并对Akt1进行活性鉴定。以Akt1(全长)-pcDNA3.1重组体为模板,采用PCR扩增目的基因,然后克隆入真核表达载体pcDNA3.1;将His-Akt1-pcDNA3.1转染HEK293细胞表达,Ni-NTA纯化His-Akt1,用SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色及免疫印迹鉴定蛋白纯度;蛋白经透析后,免疫印迹检测Akt1 Ser473和Thr308磷酸化水平。His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体构建成功,在HEK293细胞中高效表达;考马斯亮蓝染色和免疫印迹结果显示,取2 mg过表达His-Akt1的蛋白混合液经Ni-NTA纯化后,加入含100 mmol/L咪唑的洗脱液洗脱,可获得高纯度His-Akt1重组蛋白。上述His-Akt1重组蛋白经透析后,免疫印迹结果显示His-Akt1 Ser473和Thr308磷酸化水平(活化水平)均呈高水平。重组His-Akt1-pcDNA3.1真核表达载体成功构建,且蛋白高表达,His-Akt1经提取纯化后具有较高的酶活性。
- 孟利杜彩萍
- 关键词：AKT1真核表达载体蛋白纯化活性鉴定
- 核酸染色剂对DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移速度的影响被引量：2
- 2020年
- 核酸染色应用在许多DNA检测相关的技术领域,然而染色剂结合DNA会造成电泳迟滞。为研究溴化乙锭(ethidium bromide,EB)和GelRed这2种核酸染色剂对DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移速度的影响,分别用这2种染色剂采用前、后染色的方法对DNA进行染色,以琼脂糖凝胶电泳作为检测方法,凝胶成像系统拍照观察,用Reptation理论分析数据。研究结果表明EB和GelRed染色均使DNA迁移发生了滞后,但EB对于目的基因片段大小的判读未受电泳滞后的影响,而GelRed对目的基因判读略有影响。然而,与EB相比,GelRed具有荧光效果强、安全、环保等诸多优点。总之,需要精确鉴定目的基因片段大小可以选择后染色或EB前染色,对于鉴定目的基因片段大小要求不高且需要荧光效果好、环保的染色剂可以选择GelRed。
- 薄秀梅
- 关键词：EB琼脂糖凝胶电泳
- 大鼠SUMO特异性蛋白酶1催化区蛋白制备及功能鉴定
- 2022年
- 目的:制备大鼠SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific protease,SENP1)催化结构域(SENP1C)蛋白,并鉴定其酶活性。方法:分别以大鼠SENP1-pcDNA3.1和EGFP-pcDNA3.1重组体为模板,PCR扩增目的基因,克隆入pGEM-T载体;酶切鉴定后,再亚克隆入原核表达载体pET-28a;阳性重组体导入原核表达细胞BL-21,异丙基硫半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达;SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白质的表达。Ni-NTA吸附纯化蛋白质并透析处理,SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白质的纯度;1μmol/L及5μmol/L Tat-EGFP分别孵育HT22细胞不同时间,荧光显微镜下观察细胞转染情况。采用5μmol/L Tat-SENP1C预孵育HT22细胞10 h,免疫印迹检测整体蛋白质的SUMO化水平;用5μmol/L Tat-SENP1C预孵育HT22细胞或过表达Myc-Akt1和HA-SUMO1的HT22细胞10 h后,免疫沉淀和免疫印迹检测内源性和外源性Akt1与SUMO1的结合(SUMO化)。结果:Tat-SENP1C-pET-28a和Tat-EGFP-pET-28a重组原核表达载体成功构建,IPTG可以诱导蛋白质高表达;采用Ni-NTA纯化和透析可获得较高纯度的蛋白质;5μmol/L Tat-EGFP孵育HT22细胞10 h后,蛋白质穿膜效率较高;Tat-SENP1C重组蛋白可以显著降低HT22细胞中整体蛋白质的SUMO化以及内源性和外源性Akt1 SUMO化。结论:Tat-SENP1C-pET-28a和Tat-EGFP-pET-28a重组原核表达载体构建成功,且被IPTG诱导后可高效表达蛋白质;纯化的Tat-SENP1C蛋白具有较强的穿膜能力及酶活性。
- 孟利杜彩萍
- 关键词：催化结构域原核表达载体
