广东省科技计划工业攻关项目(2011B040200010)
- 作品数：5 被引量：22H指数：3
- 相关作者：王静袁文赵维波张钰黄韧更多>>
- 相关机构：广东省实验动物监测所更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目广东省教育部产学研结合项目国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生更多>>
- 小鼠诺如病毒分离鉴定及病毒衣壳蛋白基因序列分析被引量：4
- 2013年
- 目的了解广东地区小鼠诺如病毒（murine norovirus,MNV）的分子遗传特征和进化来源。方法采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞对RT-PCR检测为阳性的小鼠样本进行病毒分离,通过细胞病变、RT-PCR、间接免疫荧光试验、测序方法对病毒分离株进行鉴定。应用RT-PCR技术针对15株MNV分离株的VP1基因的1626个核苷酸片段进行基因扩增,将扩增产物连接在pMD18-T载体后转化到大肠杆菌中进行克隆。通过氨苄青霉素平皿筛选,将鉴定为阳性的克隆菌进行核苷酸序列测定及序列分析。将这15株MNV分离株与从GenBank获得的19株MNV参考株进行序列比较分析,基于VP1基因的1626核苷酸片段构建系统发生进化树,一起进行分子流行病学研究。结果从80个小鼠样本中分离到了15株MNV病毒,通过细胞病变试验、RT-PCR试验、间接免疫荧光试验和测序分析鉴定确认分离到的病毒为MNV。序列分析结果显示MNV分离株的VP1蛋白基因全长均为1626个核苷酸,广东地区15株MNV分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别在89.7%~100%和94.8%~100%之间,15株MNV分离株与其他19株MNV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别在87.5%~92.9%和92.4%~98.2%之间。进化树分析表明来自设施A和设施D的13株病毒之间的亲缘关系较近,同属一个进化分支。来自设施B的ZD-1毒株和设施C的ZYY-163毒株与来自广东（K162）、日本（S7-P2、S7-PP3）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE、Berlin/05/06/DE）同属另一个进化分支。结论成功分离到15株MNV病毒。遗传进化分析表明广东地区的MNV分离株来源并不相同,来自设施B和设施C的MNV分离株与国外分离株的亲缘关系较近,而来自设施A和设施D的13株MNV分离株可能是本地固有的毒株。
- 袁文张谱华王静刘香梅赵维波张钰黄韧
- 关键词：病毒分离鉴定遗传进化分析
- 猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：9
- 2013年
- 目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。
- 王静张鈺闵凡贵袁文赵维波
- 关键词：TAQMAN探针
- 结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：13
- 2015年
- 目的建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的检测。方法根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线;进行特异性、敏感性和重复性试验,最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本,验证在临床应用中的效果。结果该方法特异性强,与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应。构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数r2=0.9986,可以检测到10 copies/μL的质粒标准品,对MNV活病毒检测可检测到1.78×10-2TCID50/m L的病毒,检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍,比病毒分离高100倍。对5份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。通过对344份临床样品检测,检测到阳性样品103份,阳性率29.94%。有5份样本结果为假阴性。结论建立的MNV荧光定量RTPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查。
- 袁文王静赵维波张钰郭鹏举黄韧
- 关键词：荧光定量RT-PCR内标
- 一株小鼠诺如病毒的分离和鉴定及全基因组序列分析被引量：1
- 2014年
- 小鼠诺如病毒（Murine norovirus,MNV）属于杯状病毒科诺如病毒属成员,是2003年新发现的感染实验小鼠的病毒,也是目前已知的小鼠病毒中感染率最高的一种病毒。本研究利用RAW264.7细胞从MNV感染小鼠的盲肠内容物中进行病毒分离,采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法、病毒空斑试验、TCID50试验、电镜观察、间接免疫荧光试验和测序分析等方法对分离到的病毒进行鉴定,结果显示RAW264.7细胞接毒24~48h后出现明显的细胞病变,表现为细胞圆缩、变亮、聚集,最后大部分细胞死亡脱落。分离株在RAW264.7细胞上传代至第2~3代时可出现稳定的细胞病变。经病毒空斑试验获得一株纯化病毒,病毒滴度TCID50为105.25/0.1mL。电镜观察可见明显的病毒颗粒,颗粒呈球形,无囊膜,直径约30~35nm。分离株经鉴定后命名为MNV Guangzhou/K162/09/CHN。采用RT-PCR技术分段扩增基因组开放阅读框（ORF）,同时应用3′-RACE和5′-RACE技术扩增基因组的3′-UTR和5′-UTR,分别对扩增片段进行克隆和测序,经拼接后获得分离株全基因组序列。结果显示分离株基因组序列全长7 380个核苷酸（GenBank登录号：HQ317203）,将分离株全基因组序列与GenBank登录的国外参考毒株进行同源性比较,结果表明该毒株与其他MNV分离株核苷酸同源性为87.4%~89.7%。基于VP1蛋白核苷酸序列绘制MNV毒株系统发生进化树,结果表明该分离株与来自日本（S7-P2和S7-PP3）、美国（CR3和CR18）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE和Berlin/05/06/DE）的毒株进化距离较近,同属一个进化分支。本研究是国内首次对MNV病毒进行分离鉴定和全基因组序列分析的报道。
- 袁文张钰王静刘香梅赵维波黄韧
- 关键词：遗传进化分析
- SIVmac251恒河猴感染疾病模型指标观察
- 2014年
- 建立猴免疫缺陷病毒(SIVmac251)感染恒河猴模型,为AIDS疾病模型研究提供基础数据。SIVmac251毒株经静脉接种感染5只恒河猴,定期静脉采血,进行病毒载量、T淋巴细胞亚群、病毒抗体、细胞因子检测。结果显示,在感染急性期,血浆病毒载量在接种病毒一周后达到高峰,高病毒血症维持约3到4周;CD3+CD4+T淋巴细胞出现一过性下降,血浆中IFN-γ上升,IL-12下降,IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α维持在正常水平或未能检出。感染无症状潜伏期,血浆病毒载量维持在104 RNA拷贝/mL以上,疾病晚期出现上升或下降趋势;CD3+CD4+T淋巴细胞逐渐下降;CD4/CD8在疾病晚期也下降;抗SIV抗体明显上升,血浆中IFN-γ、IL-12、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α未出现明显的变化。通过对上述各项指标分析,SIV感染显示与人HIV感染相似的变化,是人AIDS研究较好的动物模型,本研究为SIV感染模型的建立和应用提供了基础数据。
- 张钰王静刘香梅闵凡贵郭鹏举黄韧
- 关键词：疾病模型恒河猴
