山东省自然科学基金(ZR2010CM012)
- 作品数：11 被引量：57H指数：5
- 相关作者：王洪梅何洪彬仲跻峰侯明海王长法更多>>
- 相关机构：山东省农业科学院东北农业大学吉林农业大学更多>>
- 发文基金：山东省自然科学基金山东省自然科学杰出青年基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 表达hTERT及SV40T永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立被引量：5
- 2013年
- 构建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T载体,线性化后,共转染荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞,研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40 T)对荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养的作用,并对细胞进行RT-PCR检测分析及免疫荧光鉴定。结果表明,hTERT和SV40 T在奶牛乳腺上皮细胞中表达可以有效地延长细胞的体外培养时间,增加细胞传代次数,获得的细胞系可以正常表达角蛋白。说明在体外培养的乳腺细胞中共表达hTERT和SV40 T可以有效延长细胞寿命且不影响乳腺细胞特性。
- 上官陶王洪梅冯敏燕仲跻峰何洪彬
- 关键词：永生化
- 不同激素组合对山东白山羊同期发情的比较研究被引量：4
- 2013年
- 以山东白山羊为研究对象,应用国产的孕酮阴道海绵栓,结合PMSG/FSH、PG和HCG,将78头受体羊随机分为4组进行同期发情及卵巢排卵研究。结果显示:放栓15 d,同时在去栓前3 d肌注400 IU/只PMSG和去栓前1 d肌注0.1 mg/只PG,鉴定发情后再肌注100 IU/只HCG处理方案效果最好,发情率为84.21%,黄体形成率为75%。同时手术检查卵巢卵泡和黄体形成情况,处理方案中放栓15 d+PMSG+PG+HCG组卵巢上均有多个排卵黄体,并且排卵窝比较明显。该研究所优化的方案为获得高质量的转基因胚胎移植受体羊提供了技术支持。
- 郇延军赵贵民雷安民王基隆韩猛刘来兴武建明上官陶王洪梅何洪彬
- 关键词：激素组合同期发情胚胎移植卵巢
- 人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备被引量：1
- 2013年
- 本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;West-ern blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。
- 辛婷婷王洪梅刘文浩孙涛王立群何洪彬
- 关键词：MXA原核表达抗血清
- 牛Nramp1基因启动子的克隆及其活性分析被引量：17
- 2011年
- 【目的】牛Nramp1基因是主要的抗病候选基因,但其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究欲确定牛Nramp1基因的启动子区域,找到启动子核心序列和主要的调控区,探索Nramp1基因表达机制。【方法】采用基因克隆、DNA测序、半定量RT-PCR和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建牛Nramp1基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同节段的pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒,分别转染293T和RAW264.7细胞,并进行脂多糖(LPS)诱导,对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定。【结果】牛Nramp1基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,+58—-89区域具有基本的启动子功能,+58—-1 748启动子活性最强。进一步研究表明,-89—-205 bp区域、-278—-1 495 bp区域存在着正调控元件,在-205—-278 bp区域内存在着负调控元件;另外,LPS能显著增强启动子活性,其诱导牛Nramp1基因的表达具有细胞特异性和剂量依赖性。【结论】成功构建了含推测的牛Nramp1基因启动子片段的重组报告基因载体,确定了启动子核心区域和主要的调控区域。
- 王洪梅张利博侯明海王长法王玲玲孙涛何洪彬仲跻峰
- 关键词：启动子活性调控区LPS诱导
- 山东地区牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定被引量：3
- 2013年
- 从山东某地区发生呼吸道症状的奶牛场中采集样品,按常规方法处理后,接种牛肾细胞(MD-BK),分离病毒,盲传3代后,接种病料的MDBK细胞出现细胞圆缩、聚集成葡萄串样群落、在单层细胞上形成空洞等病变,且随着传代次数的增加,细胞病变更加规律。对所分离病毒进行TCID50测定,其TCID50值为108/ml;用IBRV特异性引物对分离病毒进行PCR扩增,获得与设计基因片段大小一致的特异性条带,序列测定分析结果确认所分离病毒为牛传染性鼻气管炎病毒。
- 宋玲玲杨宏军冯敏燕侯佩莉王洪梅何洪彬
- 关键词：牛传染性鼻气管炎病毒聚合酶链式反应
- 牛流行热病毒山东地方株的分离与鉴定被引量：7
- 2013年
- 利用BHK-21细胞,接种山东济南地区疑似牛流行热病牛高热期的抗凝血,经盲传3代,分离到1株病毒,经RT-PCR鉴定为牛流行热病毒,命名为BEFV-SD。理化特性试验表明:BEFV-SD对热敏感,56℃10 min、37℃18 h可被灭活,对乙醚、氯仿等敏感;BEFV-SD可被BEFV阳性血清中和,中和效价为1∶408;将BEFV-SD的G基因与GenBank中公布的BEFV进行同源性比较,同源性达到96.3%以上。
- 王洪梅侯佩莉杨宏军宋玲玲何洪彬
- 关键词：牛流行热病毒同源性
- 牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定被引量：4
- 2013年
- 牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体,该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变,经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实,该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒,TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/ml。该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。
- 侯佩莉杨宏军宋玲玲王洪梅刘来兴何洪彬
- 关键词：牛病毒性腹泻-粘膜病病毒
- 中国荷斯坦牛SLC11A1基因多态性与乳腺炎的相关性研究被引量：6
- 2011年
- 【目的】通过研究中国荷斯坦牛SLC11A1基因多态性与乳腺炎性状间的相关性,为奶牛乳腺炎抗性选育提供参考。【方法】采用巢式PCR、降落PCR和DNA测序等技术,研究分析771头牛SLC11A1基因外显子10、内含子9和11的基因多态性,采用SHEsis和PHASE软件进行配对连锁不平衡和单倍型分析。【结果】发现4个不连锁的SNPs,分别为内含子9的6 067(A/G)、6 358(C/T),外显子10的7 155(A/G)和内含子11的7 809(A/T);其中,6 067(A/G)、6 358(C/T)和7 809(A/T)为新SNPs。不同基因型与乳腺炎相关性分析结果表明,SLC11A1基因的6 358(C/T)和7 155(A/G)对SCS和产奶量有显著影响(P<0.05),6 358(C/T)的CC基因型和7 155(A/G)的AA基因型是优良基因型;单倍型分析表明,群体中共发现16种单倍型组合,其中CAAA是优良的单倍型组合,其个体的SCS低、产奶量高。【结论】SLC11A1基因CAAA单倍型组合可能是奶牛SCS和产奶量的优良基因型和单倍型组合,可作为分子标记应用于奶牛乳腺炎抗性筛选。
- 郭洋王洪梅侯明海王长法何洪彬吕文发仲跻峰
- 关键词：中国荷斯坦牛基因型单倍型乳腺炎
- 中国荷斯坦牛CXCR1基因第二外显子新SNPs与乳腺炎的关联分析被引量：4
- 2011年
- 通过研究中国荷斯坦牛趋化因子受体1(Chemokine(C-X-C motif)receptor1,CXCR1)基因多态性与乳腺炎间的相关性,找到对乳腺炎性状有显著影响的基因型和单倍型组合,为从遗传角度上解决奶牛乳腺炎问题提供参考。采用巢氏PCR、DNA测序和CRS-PCR-RFLP方法,对中国荷斯坦牛的CXCR1外显子2进行遗传多态性研究,分别利用SHEsis软件和PHASE软件进行配对连锁不平衡分析和单倍型分析。结果表明,找到了4个新SNPs,分别为291(C/T)、333(C/T)、337(A/G)和365(C/T)。各SNPs与中国荷斯坦牛体细胞评分(SCS)和产奶量的关联分析表明:337(A/G)和365(C/T)位点的等位基因G、C均为低SCS、高产奶量的优秀等位基因;另外,H3 H7(CCCTGGCC)单倍型杂合个体为低SCS、高产奶量的优秀单倍型组合。CXCR1基因的单倍型H3 H7(CCCTGGCC)在SCS和产奶量方面是优良的单倍型,可作为选择抗乳腺炎的分子标记。
- 周雷王洪梅王长法柳楠侯明海李秋玲仲跻峰
- 关键词：中国荷斯坦牛乳腺炎抗性单倍型
- 肠道病毒71 VP1基因的原核表达及其抗血清的制备被引量：5
- 2013年
- 目的克隆并表达重组肠道病毒71(EV71)VP1基因,进行抗血清的制备并检测抗血清效价。方法利用原核表达系统将PCR获得的VP1片段构建成原核表达载体pET32a(+)-VP1,诱导其表达VP1融合蛋白并利用包涵体纯化方法进行重组蛋白的纯化,将纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备VP1抗血清,ELISA检测抗体效价。同时构建真核表达载体,利用其在真核细胞中的瞬时表达检测抗血清的特异性。结果通过克隆获得VP1原核表达载体,IPTG诱导VP1蛋白表达并纯化,SDS-PAGE结果显示重组蛋白表达且纯化浓度较高,将重组蛋白乳化后免疫新西兰兔3次,取血检测抗血清的效价,ELISA结果显示抗体效价为1∶64 000,利用所构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP1表达VP1对抗血清进行检测,Western blot结果表明抗血清可较好的与VP1特异性结合。结论制备具有免疫原性的VP1蛋白及其效价较高的抗血清,为进一步研究抗EV71诊断方法、血清学诊断试剂盒及抗病毒疫苗的研制奠定基础。
- 谢维欣武建明李杰方永志王洪梅何洪彬
- 关键词：肠道病毒71VP1抗血清抗体效价
