河南省科技攻关计划(122102310268)
- 作品数：10 被引量：63H指数：5
- 相关作者：黄学勇李懿张相萍翟明强李洋更多>>
- 相关机构：河南省疾病预防控制中心安阳市疾病预防控制中心郑州大学更多>>
- 发文基金：河南省医学科技攻关计划项目河南省科技攻关计划河南省卫生科技创新型人才工程更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆、表达及活性鉴定
- 2013年
- 肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）是引起手足口病最为常见肠道病毒，其中EV71是引起当前我国手足口病的病原优势株。目前临床对EV71感染以对症治疗为主，尚无有效的抗病毒药物，研制安全有效的疫苗和早期诊断试剂是预防控制手足口病疫情的经济有效地措施，为此进行以下相关研究。
- 黄学勇李幸乐胡晓宁杜燕华许玉玲卫海燕陈豪敏许汴利
- 关键词：肠道病毒71型原核表达抗原性
- 安阳地区2013年手足口病柯萨奇病毒A6 VP1基因特征研究被引量：15
- 2016年
- 为了解2013年安阳地区手足口病病原谱组成特点及柯萨奇病毒A6(CV-A6)VP1基因特征,采用实时荧光逆转录PCR方法对全年采集的临床手足口病例的479份粪便标本进行检测和分型,统计各型肠道病毒阳性标本数量及比例。对10份CV-A6阳性标本VP1基因进行扩增测序以获得全序列。使用BIOEDIT 7.2和MEGA 5.1软件对获得序列和NCBI数据库中检索到的参考序列进行VP1基因核苷酸、氨基酸相似性及系统发育分析。研究结果显示,检出肠道病毒阳性标本共429份,其中CV-A6阳性标本为90份,占全部阳性标本的比例为20.98%,这是安阳地区首次记录非CV-A16和EV-A71型肠道病毒列居手足口病病原谱第二位,成为手足口病主要病原之一。将成功获得的10条VP1序列与CV-A6原型株Gdula比较,发现安阳序列与Gdula VP1基因的核苷酸、氨基酸序列差异皆较大。与河南历史株HN421(2011)比较,发现有4条本地序列与HN421的核苷酸、氨基酸序列差异较大,其余6条与HN421差异较小。系统发育树显示,全部49条CV-A6序列共形成A、B、C、D四个分支。其中D分支可进一步分为D1和D2两个亚分支。安阳地区获得的10条CV-A6序列中,有6条属于D1亚分支,4条属于D2亚分支。
- 李洋张相萍翟明强黄学勇李懿
- 关键词：手足口病肠道病毒系统发育树
- 1例手足口病重症死亡病例的尸检病理观察
- 2017年
- 目的观察手足口病死亡病例组织器官病理变化,探讨病理发生机制,为临床诊断、治疗和预防提供科学依据。方法采集手足口病死亡病例组织、胸腔积液和粪便等标本,实时荧光RT-PCR检测胸腔积液和粪便标本中手足口病病原核酸,并进一步分离病毒,进行基因组测序和序列分析,并对组织标本进行HE染色病理学检查。结果胸腔积液和粪便标本EV71病毒核酸检测阳性,细胞培养分离到5株EV71毒株,基因型为C4基因亚型;病理组织学检查发现肺、肾脏、胸髓和肝脏组织病理变化。结论 EV71病毒感染是引起手足口病患者死亡的主要原因。
- 苏佳李懿徐冰赵嘉咏许汴利黄学勇
- 关键词：手足口病EV71病毒尸体解剖组织病理
- 菖蒲郁金汤联合大剂量丙种球蛋白治疗小儿重症病毒性脑炎临床研究被引量：21
- 2017年
- 目的:观察菖蒲郁金汤联合大剂量丙种球蛋白治疗小儿重症病毒性脑炎的临床疗效。方法:122例重症病毒性脑炎患儿为随机分为对照组与观察组,两组均为61例。所有患者均接受常规抗病毒、营养支持及抗感染等常规治疗,对照组患者在常规治疗基础上给予大剂量丙种球蛋白治疗,观察组患者在对照组治疗基础上给予菖蒲郁金汤。比较两组患者治疗前后脑脊液中S100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)水平及各项临床症状、体征、中医证候消失时间,并评价两组患者临床疗效。结果:观察组有率为95.08%(58/61),明显高于对照组的80.33%(49/61),差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,观察组脑脊液中S100B蛋白、NSE水平分别为(0.96±0.35)ng·L^(-1)、(9.78±2.02)ng·L^(-1),均低于对照组[(1.72±0.48)ng·L^(-1)、(20.97±4.46)ng·L^(-1)],差异具有统计学意义(P<0.05)。观察组发热、头晕头痛、神志障碍、抽搐、肌力下降、呕吐消失时间及四肢懈怠、纳呆恶心、头晕目眩、神识昏蒙、身热不退消失时间明显少于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:菖蒲郁金汤联合大剂量丙种球蛋白治疗小儿重症病毒性脑炎,可显著提高临床疗效,缓解患儿临床症状,促进患儿身体恢复,提高生存质量,且无不良反应。
- 张伟胡玉莲袁征
- 关键词：菖蒲郁金汤丙种球蛋白小儿重症病毒性脑炎中西医结合
- 2011-2015年安阳地区手足口病相关人肠道病毒B种病原组成及柯萨奇病毒B2、B5 VP1基因特征分析被引量：9
- 2016年
- 目的：调查2011—2015年安阳地区手足口病（ hand,foot and mouth disease, HFMD）相关人肠道病毒B种（HEV-B）病原组成,对柯萨奇病毒B2（CVB2）和柯萨奇病毒B5（CVB5）VP1基因特征进行研究。方法使用实时荧光逆转录 PCR 和半巢式逆转录 PCR 法对柯萨奇病毒 A16（CVA16）、肠道病毒71（EV71）以及其他肠道病毒进行鉴定,以获得完整的手足口病病原组成,统计出HEV-B病原种类及阳性比例。针对HEV-B病原中阳性病例数较多的CVB2和CVB5病原,分别以其VP1基因为靶段设计引物 PCR扩增测序后获得 VP1基因核苷酸序列全长。使用 MEGA7.0和BioEdit7.2软件对本研究获得的CVB2、CVB5序列以及GenBank数据库已收录的全部相关VP1序列构建系统发育树并进行系统发育分析。使用DateMonkey在线分析程序对我国近年来流行的CVB2和CVB5毒株的VP1基因进行选择压力分析。结果2011—2015年安阳地区共鉴定出手足口病相关HEV-B病原14种,HEV-B阳性标本57份。 HEV-B病原占手足口病全部病原种类的比例为56%, HEV-B阳性标本占总肠道病毒阳性标本的比例为3.06%。绝大多数HEV-B病原引起的手足口病呈高度散发,个别病原如 CVB2、CVB5在特定时间内的病例较为聚集。经过测序获得安阳地区8条CVB2和9条CVB5 VP1序列。构建的系统发育树显示,CVB2毒株可分为A-D四个基因型,各基因型的组间平均进化距离介于0.191-0.208,核苷酸序列相似性介于79.7%-85.8%。 CVB5毒株可分为A-F六个基因型,各基因型的组间平均进化距离介于0.170-0.285,核苷酸序列相似性介于76.0%-86.8%。 CVB2 VP1基因氨基酸序列第157、263位,CVB5 VP1基因氨基酸序列第75、90、95位在不同基因型毒株中的残基有较大差异。安阳地区CVB2序列均属于D基因型,且集中于1个分支内；CVB5序列均属于F基因型,分布于其中2个分支内。中国大陆地区近年流行的CVB2（ D基因型）和CVB5（F基因亚型）毒株的进化�
- 李洋张相萍翟明强黄学勇李懿
- 关键词：手足口病肠道病毒系统发育树
- 肠道病毒71型外壳蛋白VP2基因重组表达及活性鉴定被引量：1
- 2014年
- 目的 克隆表达肠道病毒71型（EV71）外壳蛋白VP2,鉴定重组蛋白免疫活性,为EV71血清学检测试剂和疫苗研究提供依据.方法 利用PCR技术从EV71/Henan/106/2009河南分离株基因组扩增VP2基因,经酶切连接到表达载体pMAL-c2X中,转化大肠杆菌（E.coli TB1）;用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的基因表达,并对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白分析鉴定其免疫活性;建立ELISA检测EV71 IgM抗体方法,检测手足口病患儿急性期中和抗体阳性血清60份,其中阳性52份,阴性8份;检测临床诊断手足口病患儿急性期血清标本88份.结果 PCR方法扩增的VP2基因长度约为762 bp;经酶切鉴定插入到表达载体的基因片段与预期目的片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为71 500;经大肠杆菌高效表达和纯化获得了重组蛋白EV71-VP2,通过Western blotting分析,该重组蛋白与手足口病患者血清反应产生特异杂交带;建立ELISA检测方法的灵敏度为87％,特异度为83％.在临床诊断的88份手足口病患儿急性期血清标本中,抗EV71-IgM阳性48份,阳性率为55％.结论 本研究成功克隆并构建了EV71 VP2基因高效原核表达系统,初步结果显示重组蛋白具有较好的抗原性,为EV71诊断试剂的研究奠定了基础.
- 黄学勇刘国华胡小宁杜燕华李幸乐许玉玲陈豪敏许汴利
- 关键词：手足口病肠道病毒属抗原
- 2011-2015年安阳地区手足口病相关柯萨奇病毒A6 VP1基因特征被引量：7
- 2017年
- 目的 对2011-2015年安阳地区手足口病（HFMD）相关柯萨奇病毒A6（CVA6）VP1基因进行研究,以了解本地区CV-A6的分子流行病学特征.方法 使用实时荧光PCR方法对临床病例标本进行肠道病毒型别鉴定.设计引物对CV-A6阳性标本的VP1区进行扩增和测序.构建系统进化树并进行系统进化分析.对近年流行的CVA6中国毒株的VP1基因进行进化选择压力分析.结果 2011-2015年安阳地区检出CV-A6阳性标本365份,占总肠道病毒阳性标本的比例为19.59%.系统进化分析显示,抽样调查的22条安阳地区CVA6 VP1序列中,有5条属于D1基因亚型,另外17条属于D2基因亚型.进化选择压力分析显示,D1、D2基因亚型中国株VP1基因承受的进化选择压力（ω值）分别为0.031和0.075;在D1、D2基因亚型中国株VP1基因上分别发现正选择氨基酸位点1处和4处.结论 2011-2015年安阳地区先后流行有D1、D2两种基因亚型的CVA6毒株.D2基因亚型对D1基因亚型的替代以及D2基因亚型的持续传播是造成安阳地区2013-2015年CV-A6型手足口病疫情的主要原因.
- 李洋包红红张相萍翟明强包小兵黄学勇李懿
- 关键词：手足口病肠道病毒属柯萨奇病毒
- 河南省濮阳市7株肠道病毒71型全基因组序列分析被引量：4
- 2016年
- 目的了解濮阳地区手足口病患者标本中分离的肠道病毒71型(EV71)病毒全基因组特征。方法选取本市发生的7例手足口病患者肠道病毒EV71型核酸阳性标本,使用人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcom cell,RD)进行病毒培养,RT-PCR型别鉴定,对分离的7株EV71型毒株通过12对引物进行分段扩增,扩增产物进行EV71型全基因组序列测定和基因进化特性分析,利用生物信息学软件对基因组序列进行分析并构建EV71病毒分类和发育图谱。结果共分离出7株EV71病毒,系统发育树显示7株病毒在分类上均属于C4亚型C4a分支。在发育相似度上主要分为两大类,其中PY464与宁波2010年NINGBO.CHN/065/2010EV71分离株相似度最高;其他6株呈现聚类,与山东临沂EV71SDLY107分离株相似度最高。在同一时期、同一地区,轻、重症病例分离株VP1区段无明显差别,而全基因区段存在一定差别。结论在濮阳市同一地区、同一时期,亦呈现出以某一种手足口病病毒为主的流行趋势。
- 徐国锋王瑞张清杰张玉华孟晓飞隋美丽李懿卫海燕黄学勇
- 关键词：肠道病毒71型系统发育
- 三门峡市手足口病病原分离检测及肠道病毒71型VP1基因分析被引量：4
- 2014年
- 了解三门峡市2011年手足口病例及健康儿童肠道病毒型别及生物学特征。本研究采集55份手足口病临床病例及60份健康儿童粪便接种敏感细胞进行肠道病毒分离,提取RNA,用荧光RT-PCR检测肠道病毒通用型(Pan-enterovirus,PE)、肠道病毒71型(Human enterovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus A16,CA16)。EV71、CA16分别用各自的VP1引物全序测定鉴定,对其它肠道病毒使用引物对012/011、008/013进行扩增测序,并与已知序列对比分型鉴定,并且对EV71病毒VP1基因特征进行了分析。临床病例肠道病毒检出率为52.73%(29/55)、健康儿童肠道病毒检出率为18.33%(11/60);临床病例检出22株EV71、4株CA16和3株其它肠道病毒,健康儿童检出肠道病毒11株,其中柯萨奇B组病毒占81.82%(9/11)。对19株EV71病毒VP1基因分析证实,三门峡市2011年流行株为C4a亚群,其进化聚类以灵宝市、卢氏县聚类最为明显。引起手足口病主要为EV71和CA16,健康儿童中存在大量的柯萨奇B组病毒,隐性感染广泛存在,2011年本地EV71病毒流行株为C4a亚群,有明显地域聚集特点。
- 武恕星武景福杨洁卫海燕许玉玲黄学勇
- 关键词：肠道病毒手足口病VP1基因同源性分析
- 柯萨奇病毒A6 TaqMan探针实时荧光逆转录PCR检测方法的建立被引量：5
- 2015年
- 目的设计柯萨奇病毒A6特异性TaqMan探针和引物,建立敏感、特异的实时荧光逆转录PCR检测方法。方法针对CVA6VP1基因,设计荧光探针和引物,优化摩尔配比,建立并优化PCR反应体系。回收PCR产物,构建重组质粒,经梯度稀释后作为模板进行敏感性试验,绘制标准曲线,评估检测方法的敏感性。对包括多种肠道病毒在内的共15种病毒进行特异性实验,评估检测方法特异性。对479份手足口病患者临床标本进行鉴定,检出的CVA6阳性标本再用普通PCR方法复核。随机抽取10份实时荧光PCR阳性产物克隆后测序,评估本方法检测临床标本的准确性。结果建立的实时荧光逆转录检测方法扩增出CVA6VP1基因的目的序列,当探针、引物摩尔配比在1︰2~1︰5时,PCR结果均较为理想,探针、引物摩尔配比为1︰3.5时,荧光强度最大。敏感性试验显示该方法扩增效率为88.9%,可检出低至2.1×102copies/ml核酸模板。特异性试验显示该方法仅能对CVA6实现特异性扩增,其他多种病毒反应均为阴性。从479份手足口临床标本中共检出CVA6阳性标本84份,与普通PCR方法复核结果一致。随机抽取的10份阳性产物克隆测序鉴定后均为CVA6目的序列。结论建立的实时荧光逆转录PCR方法具有特异性强、灵敏度高、准确可靠等优点,可用于CVA6型手足口病检测。
- 李洋张相萍翟明强黄学勇李懿
- 关键词：肠道病毒实时荧光PCR
