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乳链菌表达hGM-CSF基因的拼装及其载体pNCSF构建: 2007年; 目的体外拼装适合在乳酸链球菌表达的人粒-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,hGM-CSF),并构建载体pNCSF。方法根据hGM-CSF的氨基酸序列及乳酸链球菌偏好的密码子,将hGM-CSF基因外显子的全长碱基序列用DNAWORKS程序设计成16条互补的寡核苷酸片段,并且分别在第1条和第16条寡核苷酸片段上分别设计PstⅠ和BamHⅠ酶切位点,将相同终浓度的寡核苷酸混合进行PCR反应,完成hGM-CSF基因拼接,得到目的基因片段,对寡核苷酸片段进行拼装和扩增,产物稀释后进一步纯化扩增,在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T,然后TA克隆于pGEMTeasy载体中,经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证。然后亚克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体。结果通过PCR得到420左右目的DNA片段,获得了hGM-CSF和pNCSF阳性克隆,其DNA测序结果与设计序列完全一致。结论运用基因拼装及克隆技术成功拼装了hGM-CSF基因及构建了载体pNCSF,为乳酸链球菌表达重组hGM-CSF奠定了基础。; 马高峰张振书杨晓强武金宝陈学清; 关键词：粒-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌基因克隆

VIP调节LPS激活的树突状细胞免疫功能: 2009年; 目的研究神经肽VIP能否调节LPS激活的树突状细胞(DC)的免疫功能。方法联合应用rm GM-CSF和rmIL-4自C57BL/10.A小鼠骨髓细胞制备DC;以LPS和/或VIP刺激DC;收集DC及其上清夜行ELISA分析;自DC提取总RNA行RNAse分析。结果VIP明显抑制LPS激活的DC分泌细胞因子IL-2、IL-12和TNF-α,但对IL-6的抑制作用则不明显;VIP明显抑制LPS激活的DC表达化学因子MIP-2和-10,但对化学因子Rantes、MIP-1α和MIP-1β的抑制作用并不明显。结论VIP对LPS激活的DC的免疫功能有负性调节作用。; 陈学清张秋红刘思德肖冰张亚历姜泊李明松; 关键词：VIP 树突状细胞免疫

破伤风毒素C片段在乳链菌内的表达被引量：1: 2011年; 目的构建破伤风毒素C片段(TETC)乳链菌表达载体,并验证其生物活性。方法将采用基因拼接方法获得的TETC基因从测序正确的质粒pBS-TETC上以SalⅠ、HindⅢ切下,分别定向连接到以XhoⅠ、HindⅢ酶切的质粒分泌表达的乳链菌表达载体pNBC1000和膜锚定表达的乳链菌表达载体pNBC2000。电穿孔转化乳链菌,分别提取分泌蛋白及膜锚定蛋白,通过蛋白电泳及Western blot检测蛋白定位表达情况。结果构建了分泌表达及锚定表达TETC的乳链菌表达载体pNBCL1002与pNBCL2002,电穿孔转化乳链菌获得了分泌表达及膜锚定表达TETC的乳链菌,SDS-PAGE分析显示分泌表达的TETC大小约为57.8 kD,表达量占总体蛋白的8.06%、上清蛋白的9.82%,锚定表达的TETC大小约为73.5 kD的表达蛋白,表达量占总体蛋白的10.7%、膜蛋白的17.9%;Western blot检测显示所表达的TETC均可与破伤风抗毒素血清发生免疫印迹。结论成功构建了TETC乳链菌表达载体并在乳链菌内表达TETC,初步验证了表达的TETC的免疫反应性,这一结果可能为进一步研究生物佐剂及防治破伤风疫苗奠定基础。; 杨晓强赵亚刚孙大勇姜泊陈学清; 关键词：疫苗

艰难梭菌A毒素受体结合区基因在乳链菌中的表达被引量：2: 2009年; 目的:在乳链菌内表达艰难梭菌A毒素受体结合区并检测其活性.方法:提取艰难梭菌标准株基因组DNA,扩增编码艰难梭菌毒素A毒素受体结合区的羧基未端基因重复序列(14CDTA),分别连接到乳链菌表达载体pNBC1000及pNBC2000,转化乳链菌,蛋白电泳及Western-blot检测蛋白定位表达情况.结果:成功构建了14CDTA乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了艰难梭菌受体结合区蛋白,分泌表达的艰难梭菌受体结合区蛋白大小约39.2 ku,膜锚定表达的受体结合区蛋白大小约为55.1 ku,所表达的蛋白均可与艰难梭菌A毒素多克隆抗体发生免疫印迹反应.结论:表达艰难梭菌受体结合区蛋白的重组乳链菌可以识别艰难梭菌A毒素多克隆抗体,为研制防治艰难梭菌疫苗的口服生态活菌亚单位疫苗奠定了一定基础.; 杨晓强赵亚刚孙大勇姜泊陈学清; 关键词：艰难梭菌

Bryostatin-1调节TNF-α激活的树突状细胞免疫功能被引量：2: 2010年; 目的探讨Bryostatin-1对树突状细胞(DC)免疫功能的调节作用。方法联合应用GM-CSF和IL-4自人外周血单核细胞定向分化DC;以Bryostatin-1刺激TNF-α诱导成熟的DC,收集DC及其上清夜,以FACS和ELISA方法分析DC表面免疫分子(CD80、CD83、CD86、HLA-DR和B7-H1)和细胞因子(IFN-γ、IL-1β、IL-10和IL-12)表达水平;自DC提取RNA,以Northern blot分析DC的B7-h1 mRNA表达水平;以DC为诱导细胞,进一步检测DC的免疫诱导功能。结果Bryostatin-1通过降低DC表面B7-H1表达和增强B7.2表达,以及调节DC细胞因子(IL-1b、IL-12和IFN-γ)分泌,增强DC的免疫诱导功能,PKC通道特异性的抑制剂BI明显逆转Bryostatin-1的上述作用。结论Bryostatin-1增强DC免疫功能,其机制可能是激活PKC通道。; 陈学清王静石云李明松; 关键词：树突状细胞免疫功能

基因拼装构建c-myc-hTFF2融合基因克隆载体pBS-TFF2被引量：1: 2006年; 目的体外拼装带c-myc分子标签的人三叶因子家族2(human trefoil factor family 2,hTFF2)的融合基因c-myc-htff2,并构建其克隆载体pBS-TFF2,以便为进一步构建TFF2各种表达载体打下基础。方法根据hTFF2氨基酸序列,结合乳酸链球菌氨基酸表达密码子,设计编码htff2的基因序列(cDNA);在其上游添加c-myc碱基序列作为分子标签,设计融合基因c-myc-htff2;参照pBluescript II sk(+)载体的酶切位点碱基序列,分别在c-myc-htff2的5′和3′端设计SalⅠ和BamHⅠ酶切位点;用DNAWORKS在线程序指导,将c-myc-htff2设计成14个相互互补的寡核苷酸片段,经PCR扩增得到目的基因片段c-myc-htff2;再将目的基因片段亚克隆至pBluescript II sk(+)载体,进行酶切鉴定及DNA测序。结果成功地在体外拼装了c-myc-htff2基因,完成了pBS-TFF2构建,且DNA测序结果与设计序列完全一致。结论在DNAWORKS程序指导下设计寡核苷酸并进行体外基因拼装是合成目的基因的有效方法;成功构建了c-myc-htff2融合基因的克隆载体pBS-TFF2。; 邢锐杨晓强张绍荣陈学清张振书; 关键词：三叶肽融合基因克隆载体

体外拼接破伤风毒素C片段基因被引量：3: 2008年; 目的以破伤风毒素C片段(TETC)基因为例,探讨区段基因拼接方法。方法根据已知的TETC基因序列(GenBank登记号M12739,367-1719),结合乳链菌氨基酸密码子的基因编码情况,设计适于在乳链菌内表达的TETC基因序列,为进一步克隆,根据同义突变的原理消除序列中的EcoRI和KpnI的酶切位点,在TETC基因的5′端加上SalI酶切位点,3′端加上XhoI和HindⅢ酶切位点,序列全长1383bp。将其中1380bp的片段使用DNAstar6.0设计为68条长40bp的寡核苷酸TETC_1-TETC_68,设计TETC_69作为下游引物。分3个区段分别拼接TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,随后分别以TETC_1、TETC_69为上下游引物,进行TETC全长基因的拼接,将获得的TETC基因经SalI和HindⅢ双酶切后连接到经相同双酶切的p BluescriptⅡSK(+),得到的阳性克隆经测序鉴定。结果分别拼接出大小约500bp的TETC_1-24、TETC_23-46、TETC_45-68,等浓度的3个区段混合后,拼接出了全长为1383bpTETC基因,目的基因连接到载体后测序与设计的TETC基因完全一致。结论区段基因拼接法采用分段拼接的方法先拼接出全长基因的组成部分,随后进行全长基因拼接,更适合长基因片段的体外拼接。; 杨晓强武金宝姜泊赵亚刚陈学清; 关键词：破伤风毒素

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌表达载体的构建: 2007年; 目的:构建重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳酸链球菌表达载体,为进一步研究人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在乳链菌的表达及其治疗价值奠定基础。方法:实验于2005-04/2006-03在南方医科大学南方医院消化病研究所完成。①载体pNCSF的构建:将质粒集落刺激因子及含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000质粒分别加入BamH Ⅰ和Pst Ⅰ进行双酶切,并用Apa Ⅰ、Sac Ⅰ进行双酶切鉴定,重组质粒命名为pNCSF。②SDGFP的TA克隆及载体pNCSFGFP的构建:将经过优化适合在乳链菌表达的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体,得到重组质粒pNCSF;同时设计上下游引物经PCR扩增增强荧光表达蛋白(EGFP),TA克隆后经测序验证,再连接于pNCSF获得重组质粒pNCSFGFP。③载体pTRCSF、pTRCSFGFP的建立:将获得的pNCSF和pNCSFGFP进一步克隆于穿梭载体pTR1001c,以获得人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳链菌表达载体pTRCSF及pTRCSFGFP。结果:①载体pNCSF构建结果:酶切鉴定产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳后,发现有(含启动子P59、信号肽USP45、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)720bp的目的片段。②SDGFP的TA克隆及载体pNCSFEGFP的构建结果:SDGFP阳性克隆产物经EcoRⅠ酶切鉴定得到775bp目的片段。pNCSFEGFP酶切鉴定产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳后,发现有(含启动子P59、信号肽USP45、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、SDGFP)1495bp的目的片段。③穿梭质粒pTRCSF、pTRCSFGFP酶切鉴定结果:经Xba Ⅰ、Sac Ⅰ进行双酶切鉴定,分别得到约717bp、1492bp大小目的片段。结论:获得了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子乳链菌表达载体pTRCSF及pTRCSFGFP,并经酶切鉴定和测序证实。; 马高峰张振书杨晓强武金宝陈学清; 关键词：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子遗传学链球菌属基因表达

重组人TFF2乳酸链球菌表达载体pTRTFF2的构建: 2006年; 目的构建带c-myc分子标签的人三叶因子家族2(hTFF2)融合基因c-myc-hTFF2的乳酸链球菌表达载体,以便进一步构建能表达活性c-myc-hTFF2融合蛋白的乳酸链球菌工程菌。方法根据hTFF2的氨基酸表达序列和乳酸链球菌的氨基酸密码子,以c-myc作为分子标签,设计c-myc-hTFF2的cDNA序列,并在其5'端和3'端添加SalI和BamHI酶切位点;将目的基因片段设计成14个相互互补的寡核苷酸,经聚合酶链式反应,得到目的基因c-myc-hTFF2;将c-myc-hTFF2连入pBluescriptIIsk(+)载体,构建其克隆载体pBS-TFF2并进行酶切鉴定及DNA测序;分别用SalI/BamHI和XhoI/BamHI对pBS-TFF2和pNBC1000进行双酶切反应,再通过连接反应将c-myc-hTFF2融合基因插入pNBC1000,构建c-myc-hTFF2大肠杆菌表达载体(pNTFF2);用XbaI对pNTFF2和穿梭载体pTRKH2单酶切反应,并通过连接反应将c-my-hTFF2的表达载体连入穿梭载体pTRKH2,完成乳酸链球菌表达载体pTRTFF2的构建,并进行酶切鉴定。结果成功构建了c-myc-hTFF2的乳酸链球菌表达载体pTRTFF2。结论体外基因拼装是构建目的基因有效的方法;pTRTFF2的构建为构建乳酸链球菌工程菌奠定了基础。; 邢锐杨晓强陈学清张振书; 关键词：三叶肽融合基因克隆载体

垂体腺苷酸环化酶激活多肽调节LPS激活的树突状细胞免疫功能: 2009年; 目的:研究垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)能否调节小鼠骨髓起源的LPS激活的树突状细胞(dendritic cell,DC)的免疫功能。方法:联合应用rmGM-CSF和rmIL-4自C57BL/6小鼠骨髓细胞制备DC,以LPS和(或)PACAP刺激DC;收集被激活的DC及其上清液行ELISA和流式细胞术分析;自DC提取总RNA行RT-PCR和RNase分析。结果:PACAP能明显抑制LPS激活的DC分泌细胞因子IL-2、IL-12和TNF-α(P<0.05,P<0.01,P<0.01),以及LPS激活的DC分泌趋化因子MIP-2(P<0.01),但抑制细胞因子IL-6,趋化因子MIP-1α和MIP-1β的作用并不明显(P>0.05)。结论:PACAP对LPS激活的DC的免疫功能具有负性调节作用。; 陈学清肖冰刘思德张亚历姜泊李明松; 关键词：垂体腺苷酸环化酶激活多肽树突细胞脂多糖类免疫

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