山东省自然科学基金(ZR2010CM061)
- 作品数：22 被引量：19H指数：3
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- TMD2前断裂CFTR翻译后的连接及氯离子通道功能被引量：1
- 2010年
- CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化(CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因,旨在研究翻译后水平CFTR的连接,以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域(TMD2)前的Glu838密码子后将其cDNA断裂为N端和C端两部分,与具有蛋白质反式剪接作用的split Ssp DnaB intein编码序列融合,分别插入到载体pEGFP-N1和pEYFP-N1,构建一对真核表达载体pEGFP-NInt和pEYFP-IntC。用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞(BHK),瞬时表达实验用Western blotting观察CFTR蛋白质的连接,并用膜片钳技术记录Cl-通道电流。结果显示,基因共转染细胞呈现完整的CFTR蛋白条带,膜片钳记录到全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性。结果表明split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术可用于双载体共转移CFTR基因,为CF基因治疗应用双腺相关病毒载体(AAV)转运CFTR基因,克服AAV的容量限制提供了依据。
- 朱甫祥宫贤弟刘泽隆杨树德屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：CFTRSPLITSSPDNABINTEIN蛋白质反式剪接
- 前肽缺失vWF促进细胞分泌蛋白质剪接的L303E/F309S突变体凝血第八因子
- 2012年
- 该文旨在探索前肽缺失的von Willebrand因子(vWF-ΔPro)对蛋白质剪接的L303E/F309S突变体凝血第八因子(FVIII)分泌的影响。将vWF-ΔPro基因与蛋白内含子融合的FVIII重链和轻链基因共转HEK293细胞。结果显示,转vWF-ΔPro细胞的剪接蛋白FVIII分泌量和活性分别为(196±27)ng/mL和(1.39±0.31)IU/mL,明显高于对照细胞的(116±24)ng/mL和(0.91±0.18)IU/mL。表明vWF-ΔPro可提高剪接的L303E/F309S突变体FVIII蛋白分泌量和活性。
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：VWF蛋白质剪接分泌
- RNAi介导的Bip表达下调促进基于蛋白质剪接的双链共转基因细胞分泌FⅤⅢ凝血活性被引量：2
- 2012年
- 目的探讨用RNA干扰技术下调内质网蛋白伴侣免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)的表达,对基于蛋白质剪接的双链共转凝血因子ⅤⅢ(FⅤⅢ)基因HEK293细胞分泌剪接FⅤⅢ蛋白的量和活性的影响。方法以培养的HEK293细胞,用含蛋白内含子的B区缺失型FⅤⅢ(BDD-FⅤⅢ)的重链和轻链基因表达载体共转染经Bip-siRNA处理的细胞,免疫印迹法检测Bip的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞生长,用酶联免疫吸附(ELISA)和发色分析法分析转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ蛋白量和活性。结果 RNA干扰下调Bip表达作用明显,细胞生长不受影响;Bip下调的共转基因细胞分泌的剪接BDD-FⅤⅢ和重链量分别为(142±33)μg/L和(197±43)μg/L,明显高于对照细胞[分别为(89±23)μg/L和(120±27)μg/L];Bip下调的共转基因细胞分泌的FⅤⅢ凝血活性为(1 050±160)IU/L,明显高于对照细胞[640±170(IU/L)]。结论 Bip表达下调通过促进剪接BDD-FⅤⅢ的分泌可有效提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅤⅢ基因功效,为进一步动物体内实验提供了依据。
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：蛋白质剪接
- 前肽缺失体vWF改善FVⅢ基因断裂转移细胞的重链和活性分泌被引量：1
- 2012年
- 通过转von Willebrand因子(vWF)的前肽缺失突变体(vWF-ΔPro)基因,探讨了vWF-ΔPro对双载体转凝血VⅢ因子(FVⅢ)基因的影响。将vWF-ΔPro基因和B-区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)的重、轻链基因共转染HEK293细胞48 h后,ELISA检测重链的分泌量为(142±29)ng/ml,明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(87±15)ng/ml;未转vWF-ΔPro基因时单独转重链基因的重链分泌水平很低,vWF-ΔPro存在时重链分泌量明显提高,但不如共转基因时的重链分泌,提示轻链可反式促进重链分泌;单独转轻链或与重链共转基因时轻链分泌水平均较高,且不受vWF-ΔPro影响;Coatest法检测分泌的凝血活性显示,转vWF-ΔPro基因可使细胞分泌的凝血活性明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(0.80±0.15 IU/ml vs 0.41±0.08 IU/ml)。另外,转vWF-ΔPro基因条件下,合并培养转重链和转轻链基因细胞的培养上清中,也检测到FVIII凝血活性(0.23±0.09IU/ml),提示vWF-ΔPro有助于分泌的重、轻链形成功能性异源二聚体。表明转vWF-ΔPro基因可促进双链转FVⅢ基因,为进一步动物体内实验奠定了基础。
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：WILLEBRAND因子
- 脱氧萎镰菌醇通过下调GRP78提高双链转FVⅢ基因细胞分泌重链和生物活性
- 2011年
- 双链转凝血VⅢ因子(FVⅢ)基因是克服AAV载体容量限制的有效方法,但重链分泌的低效性带来链不均衡性。本文旨在用脱氧萎镰菌醇(deoxynivalenol,DON)降解内质网分子伴侣蛋白GRP78,通过减少重链与GRP78的结合提高重链分泌,改善双链转FVⅢ基因的功效。用DON处理双链共转基因细胞,观察了双链转FVⅢ基因293细胞分泌的重链和FVⅢ活性。结果显示,用500 ng.mL-1 DON处理细胞3 h后,GRP78蛋白水平明显降低,细胞的生长不受明显影响;单独转FVIII重链基因的DON处理细胞分泌的重链量[(59±11)ng.mL-1]明显高于对照细胞[(15±4)ng.mL-1],双链共转基因时重链的分泌量进一步增加,为(146±34)ng.mL-1,活性达到(0.66±0.15)U.mL-1,明显高于双链转基因对照细胞[分别为(76±17)ng.mL-1和(0.35±0.09)U.mL-1]。结果表明,DON可通过下调GRP78改善重链的分泌性,提高双链转FVⅢ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FVⅢ基因提供了实验依据。
- 朱甫祥杨树德刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- A1区替换提高人BDD-FⅧ重链的分泌并缓解其与轻链共转基因细胞链分泌的不均衡性
- 2010年
- 双载体转凝血Ⅷ因子基因(FⅧ)可有效克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但FⅧ重链分泌的低效性导致重、轻链分泌的不均衡。重链分泌的低效性源自其A1区存在与内质网蛋白质分子伴侣结合的位点。本文在我们最近运用蛋白质剪接的双载体共转B区缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因研究的基础上,将重链的A1区替换为猪FⅧ的A1区,用融合蛋白内含子的重链和轻链转基因实验,定量分析了重链的分泌及其对共转重链和轻链基因细胞分泌剪接BDD-FⅧ蛋白和活性的影响。结果显示,变构体重链单独转基因时其分泌得到明显改善,达到89±12 ng/ml,明显高于人BDD-FⅧ重链的分泌(25±9 ng/ml);该变构体重链与轻链共转基因细胞分泌的剪接变构体BDD-FⅧ和活性分别为219±51 ng/ml和1.47±0.22 U/ml,明显高于剪接的人BDD-FⅧ的分泌量和活性(1 16±32 ng/ml和0.8±0.11 U/ml)。单独变构体重链和轻链转基因细胞合并培养后,其培养上清中检测到剪接的变构体BDD-FⅧ和活性,分别为38±7 ng/ml和0.22±0.05 U/ml,提示为不依赖细胞机制的蛋白质剪接所产生。结果表明,A1区替换后重链分泌的增强,可促进基于蛋白质剪接技术的双载体共转重链和轻链基因细胞分泌的剪接BDD-FⅧ水平和活性,并可缓解链分泌的不均衡性,为动物体内应用双AAV载体共转BDD-FⅧ重链和轻链基因研究奠定了实验基础。
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：分泌蛋白内含子蛋白质剪接
- 酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达被引量：4
- 2010年
- 最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生.为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作用的位于Pro1640～Ser1690的酸性区3(acidic region-3,AR-3)引入重链,检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响.用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞,分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性,并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接.结果显示,共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞,分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26)μg/L和(1.31±0.15)U/ml,明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞[(102±12)μg/L和(0.79±0.09)U/ml],提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用.而且,分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中,亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性[(35±7)μg/L和(0.28±0.08)U/ml],表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接.另外,转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带,直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接.为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据.
- 朱甫祥杨树德刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：蛋白质内含子蛋白质反式剪接
- 链间二硫键改善FⅧ基因断裂转移小鼠血浆重链分泌和凝血活性被引量：2
- 2012年
- 体外细胞培养实验证明,双载体共转重链A2结构域Met662和轻链A3结构域Asp1828突变为Cys的B区缺失型凝血Ⅷ因子(BDD-FⅧ)基因可使共表达的重、轻链形成链间二硫键,重链的分泌水平得到改善.本文进一步观察小鼠体内双载体转此突变体BDD-FⅧ基因后血浆中重链的分泌量和凝血活性.构建一对含Cys662突变重链和Cys1828突变轻链真核表达载体,经门静脉注射双表达载体至C57BL/6小鼠体内,用ELISA法和Coatest法分别检测小鼠血浆中重链的分泌量和凝血活性为(239±56)ng/mL和(1.09±0.25)IU/mL,明显高于双载体共转野生型BDD-FⅧ基因对照小鼠((84±25)ng/mL和(0.36±0.12)IU/mL).结果表明,链间二硫键形成可有效增强转基因小鼠的血浆重链分泌,提高血浆凝血活性,改善双载体转BDD-FⅧ基因功效,为后续应用双AAV载体的血友病基因治疗研究提供实验依据.
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：凝血活性
- 引入糖基化位点和L303E/F309S突变促进intein介导的断裂凝血Ⅷ因子剪接被引量：1
- 2010年
- 作者最近证明intein的蛋白质剪接技术可用于双载体转B区缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,在此基础上,本研究将具有促FVIII分泌作用的L303E/F309S双突变和B结构域糖基化位点引入BDD-FVIII重链,观察重链变体对intein剪接的BDD-FVIII蛋白分泌和活性的影响。用分别融合Ssp DnaB intein的重链变体(DMN6HCIntN)和轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA分析分泌至培养上清液中的剪接BDD-FVIII蛋白量,并用发色法检测培养上清液的凝血生物活性。结果显示,DMN6HCIntN和IntCLC共转基因细胞上清液中剪接BDD-FVIII的浓度为(149±23)ng.mL-1,活性为(1.12±0.14)u.mL-1,明显高于intein融合的野生型重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)共转基因细胞[(99±14)ng.mL?1和(0.77±0.13)u.mL?1],提示重链变体能明显促进剪接BDD-FVIII蛋白的分泌和活性;另外,还检测到不依赖细胞机制的BDD-FVIII剪接。本研究为进一步动物体内双AAV载体转BDD-FVIII基因研究提供了依据。
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：凝血VIII因子分泌INTEIN蛋白质剪接
- AR-3可增强内含肽介导的全长凝血因子Ⅷ的基因表达
- 2010年
- 目的 观察具有促进凝血因子Ⅷ（fⅧ）重链分泌的酸性区3（AR-3）对蛋白质剪接作用连接的全长fⅧ分泌的影响.方法 以双载体转融合内含肽的全长fⅧ重链和轻链基因,并将AR-3融合于重链基因,瞬时共转培养的293细胞,用Western印迹观察转基因细胞内的蛋白质剪接;用酶联免疫吸附试验（ELISA）和Coatest法定量分析分泌至培养上清中的剪接的全长fⅧ蛋白和由其产生的生物活性.结果 共转基因细胞内可见明显的剪接fⅧ蛋白形成,培养上清中剪接的fⅧ蛋白量和活性分别为（1 12±18）ng/ml和（0.76±0.13）U/ml,明显高于共转未融合AR-3的重链与轻链基因细胞[（64±11）ng/ml和（0.37±0.05）U/ml],而且,混合培养的分别单独转AR-3融合重链和轻链基因细胞的上清中亦检测到剪接的fⅧ蛋白及活性[（27±7）ng/ml和（0.16±0.05）U/ml].结论 AR-3可通过改善内含肽剪接的全长fⅧ的分泌增强转fⅧ基因的效果.
- 朱甫祥刘泽隆缪静屈慧鸽迟晓艳
- 关键词：蛋白质剪接转基因
