国家高技术研究发展计划(SS2012AA020901)
- 作品数：5 被引量：11H指数：2
- 相关作者：李玉华李竹石杨会强杨健曾献武更多>>
- 相关机构：中国食品药品检定研究院成都生物制品研究所有限责任公司四川大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 生物制品中逆转录酶活性检查假阳性结果的原因分析及对策被引量：2
- 2012年
- 目的对造成生物制品中逆转录酶活性检查假阳性结果的原因进行分析和讨论,并探讨相应的对策。方法查阅生物制品中逆转录酶活性检查方法的相关文献,并结合实际工作中的检定结果进行分析总结。结果多种因素可造成逆转录酶活性检查结果的假阳性,可针对这些原因采取相应的策略。结论逆转录酶活性检查方法的进一步完善,对于生物制品的质量控制具有十分重要的意义。
- 李竹石杨会强李玉华
- 关键词：逆转录病毒逆转录酶
- 登革病毒1型E蛋白的原核细胞表达及多克隆抗体的制备被引量：1
- 2013年
- 目的构建登革病毒1型(DENV-1)E蛋白的原核细胞表达载体并进行原核细胞表达,并制备其多克隆抗体。方法利用聚合酶链反应(PCR)扩增DENV-1E蛋白序列,经酶切后将其插入原核细胞表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-D1-E。重组质粒转化E.Coli Rosetta(DE3)感受态细胞,目的蛋白经异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,纯化后采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分析蛋白表达情况,并用纯化后的表达蛋白免疫家兔,制备该蛋白的多克隆抗血清,用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性。结果成功构建了pET-32-D1-E原核细胞表达重组质粒,DENV-1E蛋白获得高效表达;纯化后的重组蛋白免疫家兔获得的特异性抗血清效价为1∶25 600,Western blot证实其特异性良好。结论成功构建了DENV-1E蛋白的原核细胞表达载体,并制备了可用于DENV快速检测的高效多克隆抗体。
- 汪伟丁显平杨会强李竹石谭帅赵宇刘莉娜谭昌耀曾献武
- 关键词：登革病毒原核细胞
- 登革病毒3型E蛋白的原核表达及抗体的制备被引量：2
- 2013年
- 目的原核表达并纯化登革病毒3型（DENV-3）E蛋白，并用于制备其抗体。方法采用PCR技术克隆DENV-3E蛋白基因，插入原核表达质粒载体pET-32a（＋），转化大肠杆菌RoseRa（DE3），IPTG诱导表达。表达产物经纯化后，免疫家兔，制备DENV-3E蛋白抗血清，并用于Westernblot鉴定。同时，采用ELISA测定其抗体效价，并初步应用于DENV-3的检测。结果重组表达载体经双酶切及测序证实构建正确；表达的重组蛋白相对分子质量约为65×103，主要以包涵体形式表达；用纯化的包涵体蛋白免疫家兔后，获得的特异性抗血清效价为1：20480，该血清可与DENV-3发生特异性反应。结论本研究原核表达并纯化了DENV-3E蛋白，制备了高滴度的特异性兔抗血清。制备获得的DENV-3E蛋白抗体可用于登革病毒的鉴定，为登革病毒相关研究奠定了基础。
- 林华杨会强李竹石杨健赵宇刘俐葛永红曾献武曹毅乔代蓉李玉华
- 关键词：登革病毒E蛋白原核表达多克隆抗体
- 乙型脑炎疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸回复突变对其毒力的影响被引量：6
- 2013年
- 目的:探索乙型脑炎病毒(JEV)疫苗株SA14-14-2包膜蛋白279位氨基酸(E279)MK回复突变(M279K)对其毒力的影响。方法:用重叠延伸PCR技术和基因克隆技术构建含有SA14-14-2包膜蛋白M279K突变的全长cDNA质粒pACNR-JEV(M279K),并以其为模板体外转录RNA,将RNA电转染导入BHK21细胞得到恢复病毒rJEV(M279K),并比较恢复病毒和疫苗病毒在蚀斑大小以及对小鼠神经毒力等方面的差别。结果:酶切及测序表明质粒模板成功构建,除人为引入的突变外(碱基1813处T→A),无任何碱基突变,并发现rJEV(M279K)形成比疫苗株更小的蚀斑,但毒力与疫苗株无显著差异。结论:E279回复突变影响乙脑疫苗SA14-14-2病毒蚀斑大小,但并未明显增强疫苗株对小鼠的神经毒力。
- 杨健李玉华李竹石林华汪伟刘丽娜倪谦枝曾献武杨会强
- 关键词：乙型脑炎病毒疫苗回复突变
- 乙型脑炎减毒活疫苗SAl4—14—2感染性克隆的构建、鉴定及稳定性分析被引量：3
- 2013年
- 目的构建稳定的乙型脑炎病毒（JEV）疫苗SAl4-14-2感染性克隆。方法用基因重组技术把SAl4-14—2全长cDNA克隆到质粒pACNR中，并以其为模板转录RNA，将RNA电转导入BHK21细胞包装病毒，用蚀斑实验和间接免疫荧光法检测病毒，对病毒进行传代实验及序列分析，并比较恢复病毒和疫苗株在蚀斑大小、神经毒力等方面的差别。结果酶切及测序表明质粒模板成功构建，用免疫荧光技术检测到恢复病毒蛋白表达，恢复病毒感染BHK21后可致细胞病变效应（CPE），传代实验表明病毒可以稳定感染BHK21细胞，测序表明：除人为引入的突变外（碱基473A—c）无任何碱基突变，并发现恢复病毒在蚀斑形成、小鼠的神经毒力等特性方面同疫苗株相同。结论成功构建了稳定的JEV感染性克隆，建立了用于JEV研究的反向遗传学方法，为研究JEV的致病机理、疫苗的减毒机制以及嵌合病毒疫苗的研发奠定基础。
- 杨健杨会强李竹石林华赵宇刘莉葛永红乔代蓉曹毅曾献武李玉华
- 关键词：乙型脑炎病毒疫苗反向遗传学
