国家自然科学基金(31170127)
- 作品数：11 被引量：33H指数：4
- 相关作者：周冬生张义全杨瑞馥邱业峰马立芝更多>>
- 相关机构：军事医学科学院武警总医院江苏大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划中国疾病预防控制中心青年科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 盐度和温度对副溶血弧菌运动能力的影响被引量：4
- 2014年
- 目的研究盐度和温度调节副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的运动能力。方法将副溶血弧菌接种于不同盐度(0.5%、1.0%、2.0%和4.0%)的爬动和泳动平板上,37℃静置培养4.5 h后,通过比较不同盐度条件菌苔直径的差异来判定盐度对运动能力的影响。接种副溶血弧菌至含2.0%盐的爬动和泳动平板上,并分别置于37℃和26℃静止培养4.5 h后,通过比较不同温度下菌苔直径的差异来研究温度对运动能力的影响。结果与结论副溶血弧菌爬动不受盐度的影响,而其泳动与盐度呈正相关,2.0%时达到极值,4.0%时稍微下降;与26℃培养的结果相比,37℃培养时爬动和泳动均显著增强。这些结果表明盐度和温度能够调节副溶血弧菌的运动能力。
- 董新波张义全杨瑞馥谢传晓周冬生
- 关键词：副溶血弧菌盐度温度
- 副溶血弧菌VPA1405多克隆抗体制备及应用被引量：3
- 2013年
- 目的建立副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的Western印迹方法。方法将VPA1405基因克隆到pET-28a(+)载体,转入大肠杆菌BL21中进行不可溶性表达,在变性条件下纯化得到VPA1405蛋白,制备的包涵体溶液直接免疫兔得到多克隆抗体,进而利用Western印迹检测VPA1405蛋白在野生株(WT)和opaR基因敲除株(ΔopaR)中表达水平的差异。结果成功表达纯化了6个与生物膜相关基因的蛋白;Western印迹结果显示OpaR调控子对VPA1405基因的表达呈正调控,这与表型实验结果相符。结论成功建立了VP的Western印迹实验平台,该平台可用于后续VP生物膜相关基因的调控研究。
- 闫小娟张义全王丽刘梦颖杨世亚杨瑞馥周冬生邱景富
- 关键词：副溶血弧菌生物膜WESTERN印迹
- H-NS对副溶血弧菌泳动能力的调控研究被引量：1
- 2015年
- 目的研究H-NS对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)泳动能力的调控作用。方法将VP接种于泳动实验平板上,37℃静置培养4.5 h后,通过比较不同菌株间菌苔直径的差异来判定H-NS对泳动表型的影响。提取WT和hns基因突变株(Δhns)的总RNA,采用实时定量RT-PCR方法研究H-NS对极鞭毛蛋白基因fla A的转录调控关系。将fla A启动子区DNA克隆入p HRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建Lac Z重组质粒,并将该重组质粒转入WT和Δhns中,通过比较二者中β-半乳糖苷酶活性的差异研究H-NS对fla A的调控关系。结果与结论动力表型结果显示,H-NS可促进VP的泳动能力;实时定量RT-PCR和Lac Z报告基因融合实验结果表明H-NS正调控fla A的转录。这表明H-NS至少可通过激活fla A的转录而促进VP的泳动能力。
- 王洁林磊孙凤军董新波侯书宁周冬生殷喆张义全
- 关键词：副溶血弧菌
- 评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型的建立与应用
- 2013年
- 目的建立评价副溶血弧菌毒力的Raw-264细胞模型,并以此评价副溶血弧菌临床分离株RIMD2210633株与其重要致病相关基因opaR基因敲除株的毒力。方法以Raw-264细胞为靶细胞,RIMD2210633株及其opaR基因敲除株为效应细胞,通过优化条件,利用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay建立细胞模型。结果以5倍于靶细胞的菌量感染靶细胞,37℃孵育1.5 h,离心所得上清稀释10倍后,加底物液避光显色10 min,反应条件最佳。opaR基因敲除后,菌株的Raw-264细胞毒性升高,并有统计学差异。结论利用副溶血弧菌标准强毒株RIMD2210633菌株建立了评价副溶血弧菌毒力的RAW-264细胞模型,并利用此平台比较了该毒株与其opaR基因敲除株的毒力,为研究副溶血弧菌的致病机制奠定了基础。
- 马立芝郭李平王立祥赵志兵张广州周冬生邱业峰
- 关键词：副溶血弧菌细胞毒性
- 副溶血弧菌的致病机制被引量：9
- 2013年
- 副溶血性弧菌是引发微生物食源性疾病的首要病原菌,其在临床上主要引起3种疾病,即胃肠炎、伤口感染和败血症。经过多年的研究,人们对副溶血性弧菌的致病机制有了一定的认识。我们着重介绍副溶血性弧菌的主要毒力因子、毒力基因表达调控及常用的毒力表型研究方法。
- 马立芝郭李平邱业峰
- 关键词：副溶血弧菌致病机制毒力
- AphA蛋白对副溶血弧菌vopT的转录调控研究
- 2015年
- 【目的】研究副溶血弧菌AphA对vop T的转录调控机制。【方法】提取野生株(WT)和aphA突变株(ΔaphA)的总RNA,采用引物延伸实验研究vop T的转录起始位点,并根据产物的丰度差异判断AphA对其调控关系。分别将WT和ΔaphA的总RNA逆转录成c DNA,利用实时定量RT-PCR进一步研究AphA对靶基因的调控关系。将vop T的启动子区克隆入p HRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建Lac Z重组质粒,并将该重组质粒转入WT和ΔaphA中,通过测定并比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性的差异来判定AphA对vop T的调控关系。PCR扩增靶基因整个启动子区DNA序列,并纯化His-AphA蛋白,利用凝胶阻滞实验(EMSA)验证His-AphA对靶基因启动子区是否具有直接的结合作用。【结果】vop T只有一个转录起始位点A(-86),且其转录活性受AphA的间接抑制。RT-PCR和EMSA结果显示AphA对vtrA的转录也具有间接的抑制作用。【结论】AphA间接抑制vop T转录,且该间接抑制作用与VtrA无关。
- 张伟侯书宁何婷徐淼黄新祥杨瑞馥周冬生张义全
- 关键词：副溶血弧菌转录调控VOPT
- 一种定量测定副溶血弧菌溶血活性的方法
- 2013年
- 目的建立定量评价副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)溶血活性的实验方法。方法以大耳白兔红细胞为靶细胞,野生型VP标准株RIMD2210633(J5421)、opaR敲除株、toxR敲除株的菌体细胞为效应细胞,通过调节感染菌量及孵育时间来优化条件,从而建立溶血活性评价模型。结果与结论 VP最佳溶血活性条件为红细胞终浓度5%条件下,用约3×106CFU的菌量感染靶细胞,37℃孵育2.5 h。opaR负调控VP的溶血活性,而ToxR正调控VP的溶血活性。本研究成功建立了定量测定VP溶血活性的方法。
- 姜汉雯王开功张义全黄倩胡小许杨瑞馥周冬生
- 关键词：副溶血弧菌溶血活性
- AphA蛋白促进副溶血弧菌c-di-GMP合成和生物膜形成被引量：4
- 2014年
- 【目的】综合运用表型和分子生化实验研究AphA蛋白对副溶血弧菌生物膜形成的调节机制。【方法】利用菌落褶皱和结晶紫染色实验比较aphA突变株(ΔaphA)和野生株(WT)的表型差异;进而利用色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法分别检测ΔaphA和WT中c-di-GMP分子含量;提取ΔaphA和WT的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;分别构建克隆有scrABC和scrG上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入ΔaphA和WT中,通过测定并比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来进一步研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;PCR扩增scrABC和scrG的整个启动子区DNA序列,并纯化His-AphA蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证AphA对靶基因启动子区是否具有直接的相互作用。【结果】表型结果显示AphA能促进c-di-GMP的合成和生物膜形成;实时定量RT-PCR和LacZ结果表明AphA能抑制scrABC和scrG的转录表达;EMSA结果证明AphA不能结合到scrABC和scrG的启动子区DNA上。【结论】AphA间接抑制scrABC和scrG的表达是其促进副溶血弧菌c-di-GMP合成及生物膜形成的机制之一。
- 黄倩张义全胡小许王丽杨瑞馥钟青萍周冬生黎晓敏
- 关键词：副溶血弧菌生物膜形成
- 两株副溶血弧菌标准株的肠毒性及细胞毒性和溶血活性比较被引量：2
- 2013年
- 目的评价两株副溶血弧菌标准株在肠毒性、细胞毒性和溶血活性上的毒力差异。方法通过兔回肠袢实验、Raw264细胞毒性实验和兔红细胞溶血实验比较临床分离株RIMD2210633(tdh+、T3SS1+、T3SS2α+、T3SS2β-、trh-)和环境分离株S251(tdh-、T3SS1+、T3SS2α-、T3SS2β-、trh-)的毒力表型差异。结果 S251株产生的肠积液量、对Raw264细胞的细胞毒性均弱于RIMD2210633株[(12.37±1.07)mlvs.(1.50±1.50)ml;(35.69±3.07)%vs.(14.07±0.91)%],且有统计学差异(P<0.05),另外S251株对兔红细胞的相对溶血活性明显弱于RIMD2210633株,且具有统计学差异(P<0.01),这与基因预测结果相符。结论 S251株的肠毒性、Raw264细胞毒性和溶血活性均弱于RIMD2210633株,该两株菌可作为后续副溶血弧菌致病机制研究的模式菌株。
- 马立芝郭李平王立祥王凤林刘亚华赵志兵张广州周冬生邱业峰
- 关键词：细胞毒性溶血活性
- 副溶血弧菌生物膜相关基因突变株的构建被引量：8
- 2013年
- 目的构建副溶血弧菌生物膜相关基因突变株并进行验证。方法采用PCR方法扩增得到靶基因的上下游同源臂片段，然后以上下游同源臂片段为模板，PCR扩增得到同源臂融合片段。将同源臂融合片段经酶切处理后克隆到自杀质粒pDSl32中。通过结合转移的方式将携带有同源臂融合片段的重组质粒转入副溶血弧菌RIMD2210633中，利用同源重组得到突变株。用PCR方法筛选和鉴定突变株，同时对突变株进行表型分析，从而在分子水平和表型试验上验证突变株是否构建成功。结果构建得到了分别携带副溶血弧菌生物膜相关基因vbfa、crp、hns、swrZ、swrT、cpsR融合同源臂片段的重组质粒，通过PCR扩增，分别得到了大小为1190、1128、1136、953、1242、1112bp的片段；用重组质粒构建了相应的突变株（AvbfR、Acrp、Ahns、AswrZ、AswrT和AcpsR），进行PCR鉴定时，突变株得到了大小分别为1190、1128、1136、953、1242、1112bp的扩增产物，比阳性对照分别小610、739、421、542、427、1367bp；用靶基因内部的引物进行扩增时，无扩增产物；选其中一株突变株Ahns进行生物膜形成能力表型分析，结果表明突变株Ahns生物膜形成量与野生株相比明显增加。结论构建得到了6株副溶血弧菌生物膜相关基因突变株，并从分子和表型试验上验证了突变株构建正确。
- 李迎丽张义全闫小娟刘梦颖杨瑞馥邱景富周冬生
- 关键词：弧菌属质粒生物膜基因敲除技术
