辽宁省自然科学基金(201102124)
- 作品数：7 被引量：17H指数：3
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- CXCR4-shRNA重组腺病毒表达载体的构建及鉴定
- 2011年
- 目的选择性构建CXC趋化因子受体4(CXCR4)的特异RNA干扰载体。方法在GenBank中获取CXCR4基因的核苷酸序列,设计并合成3条短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,并克隆到PL-Dest腺病毒骨架载体(shpAd/PL-Dest)中,组成人趋化因子受体重组腺病毒基因沉默子(shpAd-hCXCR4-eGFP),采用酶切、PCR和DNA测序方法验证。将验证后3种沉默子经酶切后转染至HEK293A细胞包装病毒,得到CXCR4的腺病毒表达载体。结果构建的shRNA-Ad-hCXCR4-eGFP 3种基因沉默子序列正确并成功克隆到腺病毒表达载体上。结论成功构建CXCR4-shRNA腺病毒表达载体。
- 陆航孙巨峰刘学政
- 关键词：CXC趋化因子受体4RNA干扰重组腺病毒载体
- CXCR4-shRNA重组腺病毒表达载体转染胃癌细胞SCG-7901的效率
- 2012年
- 目的探讨特异性沉默胃癌细胞SCG-7901中的趋化因子受体4(CXCR4)的检验效率及其进行动物实验的可行性。方法将CX-CR4的特异性RNA干扰载体转染至胃癌细胞SCG-7901 72 h后,倒置荧光显微镜观察转染情况,测定最优的MOI值,采用RT-PCR和Western印迹法进行效率测定。结果 (1)成功将CXCR4-shRNA重组腺病毒载体转染至胃癌细胞SGC7901。(2)空白组与对照组CXCR4 mRNA及蛋白表达量明显高于实验组,有统计学意义(P<0.01),而空白组与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。(3)沉默效率为82.7%。结论重组腺病毒载体CXCR4-shRNA可抑制胃癌细胞SCG7901中CXCR4基因mRNA和蛋白的表达,并可作为动物实验的理论基础和前期条件。
- 孙巨峰陆航付晓光
- 关键词：趋化因子受体4转染效率
- CXCR4-shRNA对人胃癌细胞SGC7901裸鼠腹腔转移瘤生长转移影响的实验研究被引量：3
- 2013年
- 目的探讨CXCR4-shRNA腺病毒载体对人胃癌细胞裸鼠腹腔转移瘤的抑制作用。方法构建裸鼠腹腔转移瘤模型,分为SGC7901组、空病毒组、CXCR4-shRNA组,比较3组裸鼠肿瘤体积、重量,转移灶肿瘤数,裸鼠生存时间、生存延长率、抑瘤率。Western blot检测肿瘤组织VEGF-C、MPP-2蛋白的表达情况。结果接种8～15d后裸鼠均有肿瘤长出,术区可触及大小2～3cm的结节,质硬且活动不良。shRNA组肿瘤体积平均(0.78±0.14)mm3、重量平均(1.20±0.16)g、数目平均(5.75±1.39)个,与SGC7901组[(5.61±0.44)mm3、(3.93±0.19)g、(28.86±1.83)个]及空病毒组[(4.65±0.42)mm3、(3.82±0.14)g、(27.75±1.39)个]比较差异有统计学意义(P﹤0.01);SGC7901组及空病毒组比较,差异无统计学意义(P﹥0.05)。SGC7901组生存时间平均(25.50±1.28)d,空病毒组(29.00±1.60)d,CXCR4-shRNA组(40.62±2.06)d;CXCR4-shRNA组生存延长率及抑瘤率分别为59.3%及69.5%,空病毒组分别为13.7%及2.8%。Westernblot检测结果显示,CXCR4-shRNA组VEGF-C、MMP-2蛋白表达水平明显弱于SGC7901组及空病毒组。结论 CXCR4-shRNA腺病毒载体可抑制人胃癌细胞裸鼠腹腔转移瘤的生长及转移。
- 黄林飞陆航宫喜明付晓光
- 关键词：CXCR4短发夹RNA重组腺病毒载体裸鼠胃癌腹腔转移
- RNAi沉默CXCR7对人结肠癌细胞SW620特异性靶向抑制的实验研究被引量：4
- 2014年
- 目的:探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法:(1)设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;(2)将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7 mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验表达载体;(3)MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;(4)通过细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;(5)Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果:(1)测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别为3.16×108TU/ml、4.27×108TU/ml、3.93×108TU/ml和2.95×108TU/ml;(2)3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7 mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组(P<0.05);(3)CXCR7-shRNA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有显著性差异(P<0.05);(4)SW620细胞在划痕24h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%,有统计学意义(P<0.05),划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%,有统计学意义(P<0.05);(5)CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论:CXCR7-shRNA慢病毒表达载体转染SW620细胞后可有效下调CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平并能够抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,为下一步研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的结直肠癌慢病毒基因沉默治疗打下了良好的基础,为结直肠癌的基因治疗提供了新方向。
- 王鑫陈玲孙飞陆航
- 关键词：CXCR7CXCL12重组慢病毒载体CXCR7CXCL12
- 慢病毒载体介导的CXCR 7-shRNA联合重楼总皂苷对胃癌细胞SGC 7901特异性靶向干预的实验研究被引量：4
- 2014年
- 目的探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人胃癌细胞株SGC7901后重楼总皂苷干预对CXCR7蛋白表达的影响。方法设计并合成CXCR7的3条shRNA序列及1条阴性对照序列,与pSilencerTM 4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人胃癌细胞SGC7901,RT-PCR检测用药前后CXCR7 mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验表达载体;MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SGC7901细胞的增殖的影响以及重楼总皂苷干预后的影响;Western blot检测转染CXCR7-shRNA后SGC7901细胞蛋白表达情况以及重楼总皂苷干预的影响。结果测序证实3种慢病毒载体及1组阴性对照载体均包装成功,滴度分别4.9×108pfu/mL、3.6×108pfu/mL、5.2×108pfu/mL和2.0×108pfu/mL;3组慢病毒载体转染SGC7901细胞后,CXCR7 mRNA的表达量均较阴性对照组显著降低(P<0.05),其中CXCR7-shRNA-1组和重楼总皂苷组对CXCR7的抑制率显著高于其他2组(P<0.05);CXCR7-shRNA-1转染SGC7901后,肿瘤细胞的生长增殖下降,与其他组相比有显著性差异(P<0.05);CXCR7-shRNA-1转染SGC7901后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论成功构建了3种CXCR7-shRNA慢病毒表达载体。转染SGC7901细胞以及采用重楼总皂苷处理均可有效下调CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平,并能够抑制肿瘤细胞的增殖与侵袭。因此可认为CXCR7基因在该机制中起到了至关重要的作用,为我们进一步研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的胃癌基因治疗奠定了基础。
- 赵东文李谌王海龙陆航
- 关键词：CXCRCXCL12慢病毒载体SHRNA
- CXCR7-shRNA靶向抑制结肠癌SW620细胞的体外实验研究被引量：3
- 2014年
- 目的探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法①设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列,与pSilencerTM4.1系统合成构建重组慢病毒载体,转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度;②将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620,RT-PCR检测CXCR7mRNA的表达情况,测定沉默效率,筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验的表达载体;③MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响;④细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响;⑤Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果①测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功,滴度分别3.16×108pfu/mL、4.27×108 pfu/mL、3.93×108pfu/mL和2.95×108pfu/mL;②3组慢病毒载体转染SW620细胞后,CXCR7mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低(P<0.05),其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组(P<0.05);③CXCR7-shRNA-1转染SW620后,肿瘤细胞的增殖程度显著减少,与空白组相比有统计学差异(P<0.05);④SW620细胞在划痕24h后,空白对照组和实验组的细胞迁移指数(MI)分别为(49.92±6.41)%和(29.13±5.38)%,差异有统计学意义(P<0.05),划痕48h后,对照组与实验组的MI分别为(96.52±7.44)%和(72.03±8.29)%,差异有统计学意义(P<0.05);⑤CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后,与空病毒载体组、空白组相比,CXCR7蛋白表达量明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论 CXCR7被沉默后可有效抑制SW620肿瘤细胞的增殖与迁移,这为后续研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的肿瘤基因治疗打下良好基础。
- 王鑫陈玲孙飞陆航
- 关键词：CXCR7CXCL12重组慢病毒载体
- RNA干扰沉默CXCR4基因对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭力的影响被引量：4
- 2012年
- 目的探讨特异性抑制胃癌细胞SGC7901中趋化因子受体4(CXCR4)的表达及RNA干扰对胃癌细胞SGC7901细胞增殖及侵袭力的影响。方法将腺病毒载体CXCR4-shRNA转染至胃癌细胞SGC7901,RT-PCR检测转染后CXCR4 mRNA的表达量;MTT法检测癌细胞增殖情况;Transwell小室侵袭实验对胃癌细胞侵袭力进行检测。结果 (1)成功将CXCR4-shRNA重组腺病毒载体转染至胃癌细胞SGC7901;(2)空白组与对照组细胞增殖迅速,两组之间无显著性差异(P>0.05),实验组经腺病毒载体转染后细胞增殖程度显著减少,与前两组相比有显著性差异(P<0.05);(3)shRNA-CXCR4腺病毒载体和空白组及对照组相比能显著抑制SGC7901细胞的侵袭力(P<0.05),抑制率为57.01%。空白组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论重组腺病毒载体CXCR4-shRNA能有效抑制胃癌细胞SGC7901的侵袭,并在一定程度上抑制癌细胞增殖。
- 陆航刘学政孙巨峰
- 关键词：RNA干扰胃癌细胞SGC7901细胞侵袭
