国家自然科学基金(30599433)
- 作品数：18 被引量：165H指数：7
- 相关作者：舒跃龙王敏温乐英蓝雨张晓光更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心中国疾病预防控制中心病毒北京工业大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划“十一五”国家科技支撑计划更多>>
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- 表达人高致病性禽流感病毒H5N1(安徽株)结构基因的DNA疫苗在小鼠中诱导的免疫应答分析被引量：4
- 2010年
- 本研究旨在研发经济、高效的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗并优化免疫方案。首先优化并合成H5N1(安徽株)的血凝素基因(HAop)和神经氨酸酶基因(NAop)并证实其正确表达,再构建含有H5N1(安徽株)结构基因的多个单顺反子(HAwt、HAop和NAop)和双顺反子(HAop/M2和NAop/M1)DNA疫苗质粒。随后,采用不同途径的体内电转法在第0周和第3周2次免疫Balb/C小鼠,初步分析了抗原特异性体液免疫(HA血凝抑制抗体,NA特异性抗体,中和抗体)和细胞免疫应答(IFN-γELISpot)的特点。结果表明:含有优化血凝素基因(HAop)和优化神经氨酸酶基因(NAop)的DNA疫苗可以快速激发较强的免疫应答,尤其是细胞免疫应答;皮内电转所激发的体液免疫应答强于肌肉电转。本研究为新型H5N1疫苗的研发以及免疫方案的优化奠定了基础。
- 王文陈红谭文杰邓瑶王敏刘源殷霄张柯管洁周剑芳舒跃龙阮力
- 关键词：H5N1DNA疫苗
- 人H5N1亚型禽流感病毒安徽株NS1基因的克隆及在原核系统的表达被引量：7
- 2007年
- 利用RT-PCR方法,从人H5N1亚型禽流感病毒安徽株扩增到了NS1基因,对其进行了克隆、序列测定和分析,并在原核系统高效表达和纯化了NS1蛋白.进化分析表明,A/Anhui/01/2005毒株与近些年国内分离的水禽H5N1病毒进化关系更为接近.NS1与福建、湖南分离的禽流感病毒同源性最高,分别达到99.1%和98.2%.序列分析表明,与病毒的致病性相关的92位氨基酸为Asp,与病毒的细胞因子抗性相关的80～84位氨基酸发生缺失,与断裂/多聚腺苷酸化特异性因子结合的基序改变为GFEWN,和病毒致死性相关的PL基序为ESEV.随后在大肠杆菌高效表达并纯化了NS1蛋白.Ns1基因及其编码产物的特性分析以及在原核系统的表达,为进一步研究NS1的致病机制和抗病毒药物研制奠定了基础.
- 程从升蓝雨柳燕张智清舒跃龙姚立红温乐英王大燕王伟李希妍王琦赵新生黄晶晶聂凯张晓光
- 关键词：禽流感病毒H5N1NS1
- 甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定被引量：2
- 2010年
- 目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。
- 王慧娟张陵林周为民谭文杰许洪林王文玲周剑芳舒跃龙阮力
- 关键词：单克隆抗体
- 含有人H5N1流感病毒NA基因的重组腺病毒候选疫苗株在小鼠体内诱发细胞免疫反应被引量：4
- 2009年
- 本研究旨在构建人H5N1流感病毒NA基因的重组腺病毒候选疫苗株,并考察其在BALB/c小鼠体内的细胞免疫效果。本研究选用流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)的NA基因为研究对象,分别将野生型和按照人密码子优化的NA基因插入重组腺病毒载体,构建并鉴定了两种重组腺病毒rAdV-WtNA和rAdV-Mod.NA,纯化后病毒在第0周和第4周以肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠两次,免疫剂量是109TCID50/只/次,第5周时使用Elispot方法检测并比较病毒的细胞免疫效果。结果显示,所制备和纯化的两种重组病毒均可有效表达NA目的蛋白;免疫后的小鼠均可检测出明显的针对NA抗原的特异性细胞免疫反应,而且rAdV-Mod.NA组分泌IFN-γ细胞的数量显著高于rAdV-WtNA组(P=0.016)。说明rAdV-Mod.NA是较好的人H5N1流感病毒候选疫苗株,值得进一步深入研究。
- 马晶张晓光陈红李魁彪张晓梅张柯杨亮徐红舒跃龙谭文杰曾毅
- 关键词：H5N1神经氨酸酶重组腺病毒细胞免疫
- 含有H5N1 NA基因重组腺病毒疫苗在小鼠体内的免疫效果研究被引量：1
- 2009年
- 目的考察含有禽流感病毒A／Anhui／1／2005（H5N1）优化型NA基因的重组腺病毒在BALB／c小鼠体内的免疫效果，并筛选合适的免疫剂量。方法重组病毒以肌内注射方式在第0周和第4周免疫BALB／c小鼠两次，低、中、高组的免疫剂量分别是10^5、10^7和10^9 TCID50/次，第5周时分别使用神经氨酸酶活性抑制试验和ELISpot实验来检测和比较疫苗的体液和细胞免疫效果。结果重组病毒免疫后的小鼠均可检测出针对NA抗原的特异性体液和细胞免疫反应，并且免疫效果与免疫剂量呈正相关，10^7 TCID50／只／次是合适的免疫剂量。另外，从包含NA全长氨基酸残基的合成肽库中筛选到两个能够刺激BALB／c小鼠T淋巴细胞分泌IFN-γ的表位，即NA109-124：CRTFFLTQGALLNDKH和NA182-199：AVAVLKYNGIITDTIKSW。结论含有优化型NA基因的重组腺病毒疫苗能够诱导BALB／c小鼠同时产生NA抗原特异性的体液和细胞免疫反应，是较好的H5N1流感病毒候选疫苗株，值得进一步深入研究。
- 马晶张晓光李魁彪张晓梅王敏白天杨亮徐红舒跃龙曾毅
- 关键词：神经氨酸酶腺病毒免疫
- 人高致病性禽流感病毒H5N1安徽株HA、M2蛋白双顺反子表达载体的构建及表达研究被引量：5
- 2008年
- 将我国分离的人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和M2基因片段并克隆至DNA疫苗表达载体pVRC中,构建成真核表达质粒。为提高HA的表达量,按照人偏爱密码子将HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入真核表达载体pVRC,以β-actin蛋白为内参比证明了优化后的HA蛋白表达效果明显提高。将M2基因和优化后的HA基因共同克隆入双顺反子表达载体pIRES中,获得同时表达HA或M2的双顺反子真核表达质粒;通过Western blot和间接免疫荧光检测方法,确认构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和M2。通过上述结果为进一步开展人高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感双价疫苗研发奠定基础。
- 刘源张柯谭文杰王慧娟舒跃龙胡桂学阮力
- 关键词：H5N1HAM2
- H5N1-NP蛋白的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究被引量：1
- 2010年
- 目的 原核表达并纯化禽流感病毒A/Anhui/1/2005（H5N1）的NP蛋白,并筛选人支气管上皮BEAS-2B细胞总蛋白中能够与纯化的NP蛋白相互作用的蛋白.方法 一方面,构建了含有NP基因的原核表达质粒pET30a-NP,并在大肠埃希菌中获得了可溶性表达.亲和层析和离子交换层析两步对NP蛋白进行纯化.另一方面,制备了BEAS-2B细胞总蛋白.在此基础上,联合应用Pull-down与LC-MS/MS技术来筛选并确认细胞中与纯化的NP蛋白相互作用的成分.结果 构建的pET30a-NP质粒在IPTG诱导下在原核细胞中实现了可溶表达,经过两步纯化后,得到可溶的NP蛋白纯品.Pull-down与LC-MS/MS技术初步筛选到BEAS-2B细胞中20个可能与NP蛋白相互作用的细胞蛋白.还需要进一步的实验来验证他们和NP蛋白之间的相互作用.结论 获得了高纯度的可溶NP蛋白及筛选到20个可能与其相互作用的BEAS-2B细胞候选蛋白.
- 王乃福马晶张晓光张晓梅白天王敏温乐英王大燕舒跃龙周玲曾毅
- 关键词：流感病毒A型核蛋白类蛋白质相互作用
- 1995～2005年中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行相关性研究被引量：37
- 2007年
- 为了探讨中国H3N2亚型人流感病毒血凝素基因变异与流行关系，对1995～2005年中国分离的550株H3N2流感病毒的HA1序列进行分析。HA1基因进化树显示出以很长的主干和很短的侧枝为特征。HA1的氨基酸位点变异主要位于5个已知的抗原位点及其附近，同时其它位点也有改变。通过对HA1序列资料分析发现这期间导致H3N2流行的序列改变的三种可能，第一种是同时出现多位点变化，第二种是位点变化逐渐发生累积到多个位点变化，第三种是单个抗原位点和受体结合位点同时改变，均可以引起H3N2流行。
- 董丽波张烨温乐英赵翔黄维娟蓝雨郭俊峰李梓王敏董婕郭元吉舒跃龙
- 关键词：A型流感病毒血凝素
- 人禽流感病毒H5N1多价重组痘苗病毒（天坛株）疫苗在小鼠中的免疫原性研究被引量：3
- 2010年
- 目的 研发高效广谱的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗.方法 首先构建了含H5N1（安徽株）结构基因[血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白M1与M2]的两个双顺反子（HAop/M2,NAop/M1）重组痘苗病毒（rTTV天坛株）疫苗,采用不同剂量（104 PFU或107PFU）或组合（疫苗单独或联合）方式于0、4周二次免疫BALB/c小鼠,初步比较分析抗原特异的体液（HA血凝抑制抗体、NA特异性抗体、中和抗体）与细胞免疫应答（IFN-γ ELISPOT）特点.结果 重组痘苗病毒疫苗可有效表达H5N1靶抗原;高剂量组的重组痘苗病毒疫苗可快速激发较强的针对各个抗原的抗体与针对血凝素与神经氨酸酶蛋白的细胞免疫应答,含血凝素蛋白的重组痘苗病毒疫苗亦可诱导明显的中和抗体;但各组重组痘苗病毒疫苗所激发的针对基质蛋白（M1,M2）的细胞免疫应答均较弱;两个双顺反子（HAop/M2,NAop/M1）重组痘苗病毒疫苗联合应用所激发的针对基质蛋白2（M2）的体液免疫应答明显强于单双顺反子（HAop/M2）疫苗单独应用.结论 本研究中制备的各组重组痘苗病毒疫苗可诱导多个抗原特异的体液与细胞免疫应答,该研究为新型H5N1疫苗的研发及免疫方案的优化奠定了基础.
- 王文邓瑶谭文杰陈红王敏殷霄管洁周剑芳舒跃龙阮力
- 关键词：H5N1
- H5N1禽流感病毒NS1蛋白与干扰素诱导蛋白1O表达的相关性研究被引量：2
- 2008年
- 目的 研究高致病性禽流感（HPAI）H5N1病毒NS1蛋白对干扰素诱导蛋白10（IP-10）的影响。方法 分别将禽流感病毒A／Anhui／1／2005（H5N1）的NS1基因、插入80～84位缺失氨基酸的NS1突变基因及流感病毒A／Puerto Rico／8／1934（H1N1）的NS1基因克隆至真核表达载体pEGFP-N1．转染人支气管上皮细胞BEAS-2B，流式细胞仪检测转染细胞内IP-10的表达情况。结果 与pEGFP-N1对照组相比，三种NS1蛋白均能下调BEAS-2B细胞IP-10的表达（P〈0．01），但三者之间下调程度差异无统计学意义（P〉0．01）。结论 A／Anhui／112005（H5N1）禽流感病毒单-NS1蛋白能够抑制BEAS-2B细胞IP-10表达，但这并不能完全阐明其与病毒致病性之间的关系。
- 贾晓俊周剑芳王晶钰董婕薄洪李梓李魁彪蓝雨舒跃龙
- 关键词：基因NS1基因IP-10
