国家自然科学基金(30973463)
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
- 相关作者：苏明权刘家云马越云郝晓柯李卓更多>>
- 相关机构：第四军医大学第四军医大学西京医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- Beclin1进化保守区-SA融合蛋白偶联生物素-A10适配子制备PSMA靶向系统及其对前列腺癌细胞的抑制被引量：3
- 2016年
- 目的:构建链霉亲和素(streptavidin,SA)与Beclin1进化保守区(evolutionary conserved district,ECD)融合蛋白原核表达载体,将融合蛋白与生物素-前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)特异性适配子A10偶联制备PSMA靶向系统,鉴定其促进PSMA^+前列腺癌细胞凋亡及自噬的功能。方法:采用基因合成技术获得融合基因SA-ECD,克隆至PUC57载体鉴定无误后,再将其定向插入原核表达载体PET30a,IPTG诱导融合蛋白表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blotting鉴定。按照生物素-A10∶SA-ECD摩尔比为4∶1的比例制备PSMA特异性的偶联物即靶向系统,凝胶迁移阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证SA-ECD与生物素的结合,流式细胞术、Western blotting、锥虫蓝染色分别检测靶向系统对前列腺癌细胞凋亡、自噬相关蛋白表达和细胞活力的影响。结果:双酶切及基因测序证实重组质粒PET30a-SA-ECD构建成功,IPTG诱导SA-ECD融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达并经亲和凝胶层析成功纯化。EMSA实验证明SA-ECD能有效结合生物素-A10。靶向系统可促进PSMA^+前列腺癌细胞凋亡和自噬,同时抑制癌细胞活力。结论:成功表达并纯化融合蛋白SA-ECD,构建的生物素-A10∶SA-ECD靶向系统能够杀伤PSMA^+前列腺癌细胞。
- 高萌刘家云马越云李蕊李卓苏明权唐海斌郝晓柯
- 关键词：前列腺癌
- 自噬相关基因Beclin-1的克隆及原核表达载体的构建
- 2011年
- 目的克隆并构建自噬相关基因Beclin-1原核表达载体。方法根据Beclin-1鳊码区DNA序列设计引物，用前列腺癌细胞LNCaP作为模板进行RT—PCR，扩增Beclin-1编码区全基因片段，与pQE-80质粒连接后进行潮序鉴定。结果RT—PCR扩增出Beclin-1目的基因，限制性内切酶证实其已插入表达质粒中，DNA测序证实Beclin-1鳊码区全基因片段与GenBank公布的相应基因核苷酸序列的同源性为完全一致。结论成功克隆并构建了自噬相关基因Beclin-1原核表达载体，为研究Beclin-1蛋白的细胞自噬作用奠定了基础。
- 任楠楠刘家云马越云杨静苏明权郝晓柯
- 关键词：自噬BECLIN-1反转录PCR基因重组
- 链霉亲和素-自噬相关基因融合蛋白的原核表达及纯化被引量：1
- 2014年
- 目的构建链霉亲和素(streptavidin,SA)和自噬相关基因(Beclin 1)重组质粒,并对融合蛋白SA-Beclin 1进行表达和纯化。方法利用基因重组技术将核心SA与Beclin 1序列连接,克隆入pQE80形成pQE80-SA-Beclin 1重组载体,IPTG诱导融合蛋白原核表达,镍亲和凝胶层析柱纯化融合蛋白,Western blot鉴定。结果 PCR成功扩增核心SA活性中心,酶切鉴定和测序均证实重组载体pQE80-SA-Beclin 1构建成功;IPTG诱导后SA-Beclin 1融合蛋白(含His标签)在大肠杆菌中高效表达,SDS-PAGE分析表达的融合蛋白以包涵体为主,经镍亲和凝胶层析柱纯化得到融合蛋白,Western blot鉴定其相对分子量约为72000kD,与预期相符。结论本文成功构建了重组质粒并表达纯化了SA-Beclin 1融合蛋白,为进一步研究SA-Beclin 1的功能及临床应用奠定了基础。
- 张志平刘家云刁艳君马越云苏明权郝晓柯
- 关键词：自噬相关基因融合蛋白原核表达基因重组技术PCR
