广东省自然科学基金(31685)
- 作品数：7 被引量：26H指数：4
- 相关作者：谢举临祁少海利天增徐盈斌刘坡更多>>
- 相关机构：中山大学附属第一医院中山大学中山医学院更多>>
- 发文基金：广东省自然科学基金广东省科技计划工业攻关项目广东省医学科学技术研究基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 两种不同消化方法对表皮细胞表面抗原α_6整合素和转铁蛋白受体表达的干预被引量：2
- 2005年
- 目的:采用单纯胰酶和中性蛋白酶联合胰酶两种不同的消化方式,观察表皮细胞表面抗原α6整合素和转铁蛋白受体CD71表达的变化,为荧光激活细胞分选术分选表皮干细胞选择合适的消化方法。方法:选取中山大学附属第一医院外科门诊包皮环切手术患者的皮肤标本10份,患者均知情同意,年龄14～22岁。每份标本均分为2份,分别用胰酶、中性蛋白酶联合胰酶进行消化,共20份,分为胰酶组、中性蛋白酶联合胰酶组,10份/组。胰酶组将皮条放入质量浓度为2.5g/L的胰酶中,4℃消化过夜。次日撕除表皮角质层,以弯镊轻刮皮肤上皮面,获得表皮基底层细胞;中性蛋白酶联合胰酶组将皮条放入质量浓度为2.5g/L的中性蛋白酶中,4℃消化过夜。次日轻撕下皮肤表皮层,将其剪成1mm×1mm大小的碎块,以质量浓度为2.5g/L的胰酶消化5min,获得表皮基底层细胞。分别取两组细胞悬液300μL,加入碘化丙啶标记死亡细胞,流式细胞仪检测死亡细胞百分率,计算细胞活力。以荧光标记的α6整合素和CD71抗体标记细胞表面抗原,通过流式细胞术检测抗原表达。剩余细胞以表皮细胞培养液重悬,移入预先铺有100mg/LⅣ型胶原的培养瓶中,接种密度为5×104/cm2,3d换液1次,观察两组细胞的生长情况。结果:实验纳入包皮环切手术患者的皮肤标本10份,每份标本分别用胰酶、中性蛋白酶联合胰酶进行消化,共20份,全部进入结果分析。①不同酶消化后两组细胞活力的比较:中性蛋白酶联合胰酶组细胞活力明显高于胰酶组[(86±1.81)%,(82±1.48)%,P<0.01]。②不同酶消化后两组细胞抗原的表达:胰酶组α6briCD71dim细胞占(8.00±1.69)%,α6briCD71bri细胞占(36.00±18.03)%,α6dim细胞占(40.00±10.08)%;中性蛋白酶联合胰酶组3种细胞所占比例依次为(30.00±8.59),(8.00±1.63),(38.00±8.72)%,两组各抗原的表达基本相似(P>0.05)。③不同酶消化后两组细胞形态学观察
- 刘坡祁少海谢举临黄冰舒斌徐盈斌利天增
- 胎儿毛乳头细胞的培养和鉴定及其体外诱导分化被引量：4
- 2006年
- 目的探讨胎儿毛乳头细胞（dermal papilla cells，DPCs）生物学特性和体外诱导分化潜能，论证作为组织工程种子细胞的可行性。方法Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头，Eagle动物细胞培养基（DMEM）／F12（3：1）中培养细胞，通过免疫荧光检测α平滑肌动蛋白（smooth muscle actin-α，SMA—α）、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、层粘连蛋白，对细胞的生物学特性进行鉴定。取第3、7代细胞以成脂诱导液、成骨诱导液体外定向诱导7～10d，油红染色和Von Kossa染色、骨桥蛋白免疫荧光检测鉴定细胞的成脂和成骨特性。结果体外培养的DPCs表达SMA—α、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原和层粘连蛋白，成脂诱导10d后油红染色可见细胞胞浆内红色脂滴形成，成骨诱导7d后Von Kossa染色细胞间有黑色钙结节形成，细胞表达骨桥蛋白。结论体外培养DPCs具有干细胞特性，可作为皮肤组织工程和骨组织工程一种新的种子细胞。
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- 关键词：毛乳头细胞细胞分化成骨细胞
- Ⅳ型胶原黏附法分选表皮干细胞被引量：1
- 2007年
- 目的:评估Ⅳ型胶原黏附法分选表皮干细胞的分选效果及对细胞生物学特性的影响。方法:实验于2004-11/2005-05在中山大学附属第一医院外科实验室完成。选取中山大学附属第一医院外科门诊包皮环切手术患者的皮肤标本5份(患者知情同意),进行表皮细胞的分离培养。取培养的二三代表皮细胞,消化后加入铺有100mg/LⅣ型胶原的培养瓶中分选。取分选细胞悬液于培养箱中过夜培养,第2天取出爬片,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,去除残留培养液,4%多聚甲醛室温下固定10min,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,以含0.1%Triton-100的3%山羊血清封闭、透膜20min,滴加稀释好的角蛋白K19/β1整合素抗体进行双标,4℃过夜孵育,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,加入配置好的双标用二抗,37℃下孵育20min,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,加入5mg/L的Hochest33258,标记细胞核,37℃下孵育5min,磷酸缓冲液冲洗3min×2次,滴加含40%甘油的碳酸氢钠缓冲液,盖玻片封片,以上步骤均在暗室中操作,同时以磷酸缓冲液代替一抗作为阴性对照。激光共聚焦显微镜下观察,拍照。同时表达角蛋白K19、β1整合素认为是表皮干细胞。分别取分选前及筛选后细胞各4×106个,检测表皮干细胞(α6briCD71dim细胞)、短暂扩增细胞(α6briCD71bri细胞)及终末分化细胞(α6dim细胞)的百分率及分选前后的细胞周期。结果:①分选后细胞体积小,均匀一致,核浆比例大,免疫荧光检测同时表达K19、β1整合素。②与分选前细胞比较,分选后细胞中表皮干细胞α6briCD71dim细胞、短暂扩增细胞α6briCD71bri细胞的百分率明显增高,差异显著[(9.41±0.31)%,(38.74±1.09)%;(43.66±1.12)%,(48.92±2.49)%,P<0.01]。③与分选前细胞比较,分选后细胞G0/G1期所占比例明显增高,差异显著[(80.80±1.69)%,(94.37±1.32)%,P<0.01]。提示分选后细胞处于相对静止状态的表皮干细胞所占比例高。结论:Ⅳ型胶原黏附分选出的细�
- 刘坡祁少海舒斌谢举临徐盈斌黄勇刘旭盛
- 关键词：表皮干细胞分选
- 人表皮干细胞体外分选和培养对构建组织工程皮肤种子细胞的可能性被引量：5
- 2005年
- 目的:探讨人表皮干细胞在体外分选和培养的可能性,为构建组织工程皮肤寻找理想的种子细胞。方法:实验于2002-01/12在中山大学基础医学院动物中心完成。根据表皮干细胞与Ⅳ型胶原蛋白的高黏附的特性,运用黏附实验将干细胞从培养在鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶的表皮细胞中分选出来,并从形态学、超微结构及免疫组化等方面进行了鉴定。结果:分选出来培养的细胞符合表皮干细胞的特征,说明分选培养的细胞是表皮干细胞。结论:预先在体外对表皮干细胞进行分选和培养是可行的,该细胞群有望成为构建组织工程皮肤的种子细胞,为下一步应用表皮干细胞构建组织工程皮肤奠定了牢固的基础。
- 谢举临利天增黄冰陈系古祁少海
- 关键词：生物医学工程干细胞人表皮干细胞构建组织工程分选体外组织工程皮肤
- 胎儿毛乳头细胞分化为类成骨细胞的实验研究
- 2006年
- 目的研究胎儿毛乳头细胞的体外成骨能力,为骨组织工程提供一种新的种子细胞。方法Ⅰ型胶原酶消化法分离毛乳头,常规成纤维细胞培养液培养毛乳头细胞。第3代和第7代细胞经成骨诱导液诱导培养7d,以免疫荧光、VonKossa等方法鉴定毛乳头细胞及检测细胞的成骨特性。结果培养的毛乳头细胞呈聚集性生长,表达平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原。经成骨诱导后表达骨桥蛋白,有钙结节形成。结论毛乳头细胞具有成骨活性,可作为骨组织工程的种子细胞。
- 祁少海刘坡谢举临徐盈斌盛蹼义舒斌利天增
- 关键词：毛乳头细胞
- 人工真皮替代物的构建及其生物相容性评价被引量：12
- 2004年
- 目的 构建人工真皮替代物并评价其生物相容性。方法 取自健康小白猪的异种皮肤先用 0 .5 %安多福浸泡消毒后 ,在无菌操作下 ,取厚度为 0 .3～ 0 .4mm ,经胰蛋白酶消化、冷冻干燥及戊二醛等处理后检测其理化性能和生物学相容性。结果 去细胞真皮底物具有良好的弹性、强度和组织学结构 ;人包皮成纤维细胞均能在 5～ 10min内很好地粘附 ,且生长良好 ,说明人工真皮对细胞生长无毒性 ;人工真皮在大鼠体内的免疫排斥反应轻微 ,组织相容性好。结论 本实验所构建的人工真皮具有良好的理化性能 ,生物相容性好 ,免疫排斥反应小 ,且成本低、来源广 ,是构建组织工程皮肤理想的真皮材料。
- 谢举临利天增祁少海黄冰陈系古卞徽宁
- 关键词：生物相容性
- 不同年龄人真皮多能干细胞的分离及体外分化特点被引量：4
- 2007年
- 目的研究不同年龄人真皮多能干细胞的分离、鉴定及体外分化特点。方法切取胎儿、患儿、中青年患者、老年患者正常皮肤标本（1cm×1cm），采用干细胞培养基筛选原代细胞克隆并记录其数量和直径；检测各种标本来源细胞克隆的体外分化情况；行单个细胞克隆分化分析，并检测其相关蛋白的表达。结果胎儿、患儿、中青年患者、老年患者正常皮肤原代培养获得的细胞克隆数分别为（20．1±2．5）×10^2、（15．8±5．7）×10^2、（10．8±1．3）×10^2、（6．2±1．4）×10^2个，两两比较，差异有统计学意义（P＜0．01）；克隆直径分别为（83±12）、（55±10）、（46±12）、（42±8）μm，胎儿＞患儿＞中青年及老年患者（P＜0．05）。各种细胞克隆均能向神经元细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞分化，其中胎儿来源的细胞克隆有向神经元细胞分化的优势。培养1个月，胎儿、患儿、中青年患者、老年患者单个细胞克隆形成率依次为41．1％、25．5％、17．7％、15．2％；单个细胞克隆亦能同上多向分化，同时表达巢蛋白、纤维连接蛋白、原癌基因c-mye、信号转导和转录激活因子3、端粒体逆转录酶。结论采用干细胞培养基能够有效分离不同年龄人真皮中具有克隆增殖和多向分化潜能的干细胞，年龄对其的数量、增殖和分化有明显影响。
- 徐盈斌柯昌能祁少海利天增黄冰谢举临赵李平刘坡
- 关键词：多能干细胞真皮细胞分离年龄因素
