国家科技支撑计划(2007BAD86B02-3)
- 作品数：5 被引量：14H指数：2
- 相关作者：李玉峰姜平王先炜李军星王兴龙更多>>
- 相关机构：南京农业大学更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划浙江省重点科技计划国家自然科学基金更多>>
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- 1株抗欧洲型和美洲型PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定被引量：2
- 2010年
- 利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。
- 王晓丰李玉峰王先炜王海燕姜平
- 关键词：PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体NUCLEOCAPSID间接免疫荧光试验免疫印迹试验
- 猪Toll样受体3、7和8基因的克隆与序列分析被引量：2
- 2010年
- 为了对猪Toll样受体(TLR)3、7和8基因进行克隆与序列分析,本实验从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中,利用RT-PCR方法分片段扩增猪TLR3、7、8基因,并克隆于pMD18-T载体中。根据测序结果分析,猪TLR3、7和8基因的ORF分别为2718bp、3153bp和3087bp,并分别编码906、1051和1029个氨基酸。同源性分析结果显示,它们与GenBank中登录的猪TLR的相应序列同源性达99%以上;与牛、马、羊和人的同源性较高,与鼠的同源性次之,与鸡的同源性最低,其蛋白分子结构预测表明猪TLR3、7、8均为跨膜蛋白。
- 张莉莉白娟王先炜李玉峰王兴龙姜平
- 关键词：TLR克隆
- 副猪嗜血杆菌tbpA基因PCR-RFLP分型被引量：9
- 2009年
- 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPs)是目前影响世界养猪业的重要病原之一。本试验利用针对HPs转铁蛋白基因tbpA的PCR-RFLP分型方法,对2003～2008年分离自江苏、上海、广西、浙江、江西和安徽等6省市的57个HPs分离株及15个参考菌株进行PCR-RFLP分析。结果显示,15个血清型参考菌株分为9种基因型,57个HPs流行分离株分为15种基因型,其中在我国最为流行的基因型分别为DBN(38%),ABN(18%)与DBP(12%)。本研究表明副猪嗜血杆菌在我国猪群中普遍存在,并至少有15个RFLP基因亚型,从而为我国HPs病的防治提供了重要理论依据。
- 李军星姜平王艳李玉峰陈闻王先玮李鹏
- 关键词：副猪嗜血杆菌PCR-RFLP基因型
- 副猪嗜血杆菌热休克蛋白70基因的序列分析及抗原性鉴定被引量：1
- 2009年
- 本研究利用简并引物首次从副猪嗜血杆菌基因组DNA中克隆获得全长HSP70基因(登录号:EU69-3116),基因测序结果表明HSP70完整阅读框1908bp,根据编码序列推导出相应635个氨基酸。经BLAST分析表明,其氨基酸序列与溶血性曼氏杆菌、杜克雷嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等同源性最高,达到90%左右。将HSP70部分基因克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,经酶切鉴定正确后转化感受态大肠杆菌BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE表明表达的重组蛋白约46ku,将表达的蛋白纯化后免疫小鼠,制备抗血清。Westernblot结果显示该融合蛋白与副猪嗜血杆菌人工感染猪血清以及原核表达蛋白免疫的小鼠抗血清反应后有明显的特异性条带,证明该重组蛋白具有良好的抗原性,为HSP70功能研究奠定了重要基础。
- 李军星姜平李玉峰张国龙王先炜
- 关键词：副猪嗜血杆菌HSP70原核表达抗原性
- 2株猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株对仔猪致病性的比较被引量：1
- 2009年
- 为了比较最新分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异分离株SY0608和传统毒株S1对仔猪的致病性,本研究选择9头30日龄商品仔猪,随机分为2组,分别接种2株病毒,即S1株感染组(n=5头),SY0608株感染组(n=4头),接种后隔离饲养观察2周。经临床症状观察、病理学、病原学和血常规学检查,结果:SY0608毒株感染组仔猪表现明显临床症状,接种3 d后体温急剧升高至41.8℃;白细胞数急剧减少(降低了45%);病理学变化严重,肺泡膈增宽,大部分肺组织肺泡不张;而S1株感染组仔猪仅出现轻微临床症状和病理变化。SY0608毒株感染组仔猪病毒血症持续时间较S1毒株感染组长,病毒在脏器中的分布更为广泛。SY0608株感染组血清ELISA抗体水平明显高于S1株感染组。结果表明,SY0608毒株对仔猪致病作用明显强于S1毒株。
- 唐波姜平李玉峰洪伟彬王兴龙
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
