国家自然科学基金(30470712)
- 作品数：3 被引量：6H指数：2
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 细胞色素P450 4F2基因的克隆、突变、表达和纯化被引量：1
- 2007年
- 目的构建人细胞色素P450 4F2基因野生型、V81G和V433M突变型表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化出CYP4F2蛋白。方法用RT-PCR方法从人肾脏总RNA中逆转录扩增CYP4F2,将其插入克隆载体pMD18-T Simple Vector中,将测序鉴正确的CYP4F2基因N、C端改造,克隆构建重组表达载体pCWori+-CYP4F2(His)_4-WT。同时采用重叠PCR定点突变法构建pCWori +-CYP4F2 V81G(His)_4和pCWori+-CYP4F2 V433M(His)_4表达载体,分别转化至E.Coli XL-Blue中表达。结果经IPTG诱导可有效表达CYP4F2和突变体V81G与V433M,经Western blot分析可以观察到分子量为57 kD的诱导表达条带,该表达蛋白可与His-Probe多克隆抗体起特异反应。用His- bind亲和层析纯化得到了纯度较高的His融合蛋白。结论用基因工程技术在大肠杆菌中有效表达人CYP4F2基因野生型、V81G和V433M突变型蛋白、并得到了纯度较高的CYP4F2蛋白,为进一步研究其生物学功能及研制相应抗体奠定了基础。
- 丁虎李仁立卢志南汪道文
- 关键词：CYP4F2基因克隆突变纯化
- 汉族人群花生四烯酸细胞色素P450ω-羟化酶4A11基因编码区结构的研究被引量：2
- 2006年
- 目的花生四烯酸由细胞色素P450ω-羟化酶催化生成的19-和20-羟烷四烯酸(19-, 20-HETE)。在多种疾病过程,尤其是高血压病中,20-HETE扮演着重要角色。寻找人群中该酶基因之一的CYP4A11的编码区多态性位点分布情况,可以为研究高血压病的基因机制提供新的依据。方法采集50例血压正常、无血缘关系的汉族人外周静脉血白细胞;提取基因组DNA;设计特异性引物,PCR法分段扩增基因编码区序列,电泳检测后回收目的片断;测序,与参考序列比对后统计结果。结果CYP4A11共发现16个多态性位点,其中5个有意义:1个5’端非编码区的突变位点A-54G,4 个引起氨基酸改变的多态性位点,分别为A6890C、A7207G、T7394A和T8590C。其余为同义突变或者位于内含子区。结论(1)多态性位点存在种族差异;(2)突变位点大多数位于内含子区,或者为同义突变,仅有少数有意义;(3)发现的多态性位点可能引起蛋白质构象进而改变蛋白质功能,或者引起基因转录活性的改变,并为下面的蛋白质组学研究和大样本人群研究奠定了基础。
- 杨靖李仁立汪道文
- 关键词：多态性位点
- 心肌纤维化细胞模型的构建及缬沙坦对其治疗的研究被引量：3
- 2008年
- 目的构建心肌纤维化细胞模型,并探讨缬沙坦对其的作用。方法胶原酶消化法分离心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs),取第3或4代CFs加入10-6μmol·L-1血管紧张肽Ⅱ(angiotensinII,AngⅡ)构建心肌纤维化细胞模型。0.01,0.10,1.00,10.00,100.00μmol·L-1缬沙坦干预模型4,6,8,12,24h后光镜下观察细胞生长状况。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法及吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法定量分析细胞活力,电镜技术观察亚细胞结构。结果CFs在种植3h后开始贴壁生长。加入AngⅡ后,光镜下可见细胞增生活跃。加入不同浓度的缬沙坦24h内,部分细胞呈凋亡的形态学改变。MTT提示缬沙坦浓度为10.00μmol·L-1作用8h后,CFs的生长抑制率最高。AO/EB染色表明上述条件下CFs死亡率最高,死亡方式主要为凋亡。电镜亦显示死亡细胞主要呈凋亡的形态学改变。结论在现有技术条件下体外构建心肌纤维化细胞模型完全可行。缬沙坦有效抑制模型中CFs增殖可能通过诱导其凋亡实现。
- 姜美华涂玲徐西振赵刚吴蕊
- 关键词：心肌纤维化
