国家自然科学基金(30730098)
- 作品数：10 被引量：33H指数：4
- 相关作者：赵晓东陈昕赵耀刘平李荣培更多>>
- 相关机构：重庆医科大学中国农业科学院哈尔滨兽医研究所宁夏医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市杰出青年科学基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人偏肺病毒融合蛋白N-糖基化位点的预测及不同N-糖基化修饰突变体的构建被引量：2
- 2009年
- 目的预测人偏肺病毒(hMPV)融合蛋白N-糖基化位点,构建N-糖基化修饰突变体。方法NetNGlyc1.0 Server神经网络软件预测hMPV4个亚型代表株F蛋白氨基酸序列的N-糖基化位点;根据预测结果针对性地设计突变引物,应用基因工程技术进行定点突变,从而获得特定位点去糖基化的F基因,包括单位点突变体、双位点突变体及三位点突变体;双酶切鉴定、基因序列分析重组质粒,明确N-糖基化修饰突变体构建是否成功。结果hMPV4个亚型代表株F蛋白氨基酸序列从N端起第57、172、353位均存在可能性大于50%的N-糖基化位点。构建hMPVF蛋白7个不同的N-糖基化修饰突变体,并通过序列分析测定证实重组突变质粒构建成功。结论hMPVF蛋白的N-糖基化位点保守,不同亚型的代表株有相同的糖基化位点,利用定点突变技术成功构建了糖基化突变体重组质粒。
- 谢琴芳赵晓东张琴黄路毛华伟赵耀
- 关键词：人偏肺病毒融合蛋白
- BALB／c和SCID小鼠人偏肺病毒感染特点的比较研究
- 2012年
- 目的比较研究人偏肺病毒（hMPV）在BALB／c小鼠和SCID小鼠肺内复制动力学和肺病理特点。方法GFP—rhMPV滴鼻感染BALB／c小鼠和SCID小鼠，于感染后3、5、7、9、14d处死小鼠并无菌获取心、肝、脾、肺、肾和脑用于病毒分离和病理检查，空斑形成法检测病毒滴度，RT-PCR和real-timePCR法检测hMPVmRNA表达。结果GFP-rhMPV滴鼻感染BALB／c小鼠和SCID小鼠后第5天肺组织均分离到病毒。感染GFP-rhMPV的BALB／c和SCID小鼠在感染后第5天肺组织病毒滴度均达峰值，分别为（5．25±1．69）×10^4PFU／g和（5．83±1．21）×10^5PFU／g。SCID小鼠在感染后第14天肺组织内病毒滴度仍可达（4．25±1．04）×10^1PFU／g，此时BALB／c鼠肺内已不能分离到病毒，但可检测到GFP—rhMPVF蛋白mRNA表达。感染后第5天所有小鼠的心、肝、脾、肾和脑组织内均不能分离到病毒，也无法检测到hMPVF蛋白mRNA表达。肺组织病理改变在感染后第5天最明显，为典型的间质性肺炎改变，BALB／e小鼠组肺组织病理评分略低于SCID小鼠组，差异无统计学意义。结论GFP—rhMPV滴鼻感染后只能在小鼠肺内复制。同BALB／e小鼠相比，SCID小鼠感染GFP-rhMPV后肺内病毒滴度高，复制时间久，但病理损伤无明显差异。
- 余春梅李荣培陈昕刘平赵晓东
- 关键词：人偏肺病毒BALBC小鼠SCID小鼠滴度
- 绿色荧光标记重组人偏肺病毒空斑形成滴度测定方法的建立被引量：2
- 2010年
- 目的 建立用于绿色荧光标记的重组人偏肺病毒（GFP-rhMPV）空斑形成滴度测定方法.方法 基因组中插入绿色荧光蛋白基因的hMPV全序列cDNA质粒和主要蛋白质表达质粒转入细胞293T后获得感染性重组hMPV.GFP-rhMPV在Vero-E6细胞中连续传代提升病毒滴度并保存.将等倍稀释的重组病毒液接种常规制备的Vero-E6细胞单层,用含或不含胰酶的低熔点琼脂精凝胶覆盖细胞,孵育一定时间后,采用荧光显微镜下计数荧光空斑数和抗原抗体蓝斑形成法计算病毒滴度.结果 感染后3 d,荧光显微镜下GFP-rhMPV可在低熔点琼脂糖凝胶覆盖层下形成分界较为清晰的绿色荧光集落,接种后3 d荧光空斑相对独立,便于计数.蓝斑形成法在感染后第5天蓝斑较大,易观察.此前拯救获得的GFP-rhMPV在宿主细胞Vero-E6中的复制滴度可达1×10^6 PFU以上.结论 成功建立了GFP-rhMPV的空斑形成实验滴度定量检测方法,为hMPV的致病机制、防治手段研究奠定了基础.
- 余春梅陈昕张金辉王永步志高赵晓东
- 关键词：人偏肺病毒滴度测定
- 小鼠人偏肺病毒感染模型的建立被引量：4
- 2009年
- 目的建立人偏肺病毒（hMPV）感染小鼠模型，了解病毒肺内复制规律及所致病理改变，为hMPV感染免疫病理机制研究及新型防治手段开发奠定基础。方法BALB／c小鼠经滴鼻感染荧光标记的重组hMPV，于感染后1、3、5、7、9、16d处死小鼠并无菌获取肺组织用于病毒分离和病理检查，改良噬斑形成法检测hMPV滴度，RT—PCR法检测hMPVmRNA表达。结果小鼠滴鼻感染hMPV后肺组织分离到病毒；肺组织病毒滴度在感染后5d达到高峰（5．16±1．09）×10^5PFU／g，感染后第9天仍能检测到病毒（2．79±1．22）×10^2PFU／g；感染后16d肺组织仍可检测到hMPV mRNA；病理改变在感染后3～7d最明显，为典型的间质性肺炎改变。结论hMPV感染BALB／c小鼠模型建立成功，可用于hMPV感染的免疫病理机制研究。
- 窦颖赵耀张志勇赵晓东
- 关键词：人偏肺病毒BALB/C小鼠动物模型
- 人偏肺病毒感染人肺上皮细胞后Toll样受体的表达及其功能被引量：1
- 2009年
- 目的观察人偏肺病毒（human metapneumovirus）感染人肺上皮细胞后Toll样受体（TLR）表达变化及其信号通路的功能，探讨hMPV诱导气道炎症的部分机制。方法hMPV感染体外培养的人肺上皮细胞株A549，检测病毒在A549细胞中的生长曲线，并通过RT—PCR，real—time RT-PCR方法检测细胞TLR mRNA的表达，ELISA检测细胞培养上清IFN-α及TNF-α的表达。结果（1）hMPV可在A549细胞中复制，感染后3d达高峰10^5.2TCID50／ml。（2）RT—PCR结果提示：hMPV感染A549细胞6h后大部分TLR的表达均上调。（3）定量PCR结果提示：hMPV感染A549细胞后TLR3-4、TLR7-9的表达增高，且有时间依赖性，而紫外灭活的hMPV刺激细胞后TLR表达无明显变化。（4）ELISA结果提示hMPV感染后24h，IFN—α及TNF—α的表达均明显升高。结论人偏肺病毒感染A549细胞后可上调TLR表达，其诱导的炎性反应与部分TLR介导的信号转导途径有关。
- 窦颖赵晓东赵耀
- 关键词：人偏肺病毒TOLL样受体A549细胞IFN-Α
- 人偏肺病毒感染小鼠肺内Toll样受体表达及PolyI:C对病毒感染的影响被引量：1
- 2010年
- 探讨人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后肺组织Toll样受体(TLRs)表达变化及PolyI:C对病毒复制的影响。实验小鼠分为hMPV感染组、polyI:C+hMPV组、polyI:C+DMEM组、DMEM对照组,均在滴鼻后1、3、5、7、9和16d处死,取肺组织用于病毒滴度测定、病理检查、通过RT-PCR和实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺组织内TLRs mRNA的表达。结果显示:①与hMPV感染组相比,polyI:C+hMPV组小鼠肺内病毒复制水平明显减低,仅在感染后第5d及第7d检测到病毒;病理检查结果亦提示肺部炎症明显减轻。②RT-PCR结果提示:hMPV感染组小鼠与DMEM对照组相比,肺组织内大部分TLRs mRNA表达均升高。③实时荧光定量PCR结果提示:hMPV感染后小鼠肺组织TLR7-8 mRNA增高最为显著,且有时间依赖性;滴鼻后24h,polyI:C+hMPV组TLR3的表达明显升高。提示:人偏肺病毒感染BALB/c小鼠后,可上调小鼠肺组织Toll样受体表达,其中TLR7/8途径可能在启动天然免疫应答中起着重要作用;polyI:C可通过早期活化TLR3,抑制hMPV在小鼠肺内的复制,并减轻肺部炎症。
- 窦颖赵耀张志勇赵晓东
- 关键词：人偏肺病毒TOLL样受体BALB/C小鼠
- 利用反向遗传技术制备重组人类偏肺病毒被引量：8
- 2009年
- 利用反向遗传技术,将包含人偏肺病毒2个血清型A和B代表株NL/1/00和NL/1/99全基因组cDNA的质粒及其4种辅助蛋白N、P、L、M2.1的表达质粒pCITE-N、pCITE-L、pCITE-P、pCITE-M2.1分别共转染BSR-T7细胞以制备重组hMPV。3μg全长cDNA质粒,辅助蛋白质粒pCITE-N、pCITE-L、pCITE-P、pCITE-M2.1分别为0.3μg、0.15μg、0.3μg和0.24μg,通过Lipofectamine2000转染BSR-T7细胞,转染后3天,将BSR-T7细胞于?80°C冻融一个循环以裂解细胞,取上清液感染VeroE6细胞。接种后的VeroE6细胞,6天细胞可观察到明显的细胞病变效应;RT-PCR检测出符合预期目标大小的450bp条带;间接免疫荧光实验检测感染后的VeroE6细胞可在荧光显微镜下可观察到特异性绿色荧光,结果一致表明全基因组cDNA及其辅助质粒产生了有感染性的重组hMPV病毒。用细胞病变法和测试重组病毒的病毒滴度和生长曲线,重组病毒6天时A型代表株NL/1/00在VeroE6细胞滴度为106.4TCID50/mL,B型代表株NL/1/99为105.33TCID50/mL。
- 张金辉葛金英任妍步志高赵晓东
- 关键词：反向遗传技术人偏肺病毒病毒拯救
- 玉屏风散对小鼠哮喘合并人偏肺病毒感染的干预机制探讨被引量：7
- 2011年
- 目的:建立人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)感染的哮喘小鼠模型,验证玉屏风散对hMPV诱导的哮喘小鼠气道高反应性和炎症的疗效并初步探讨其机理。方法:随机将48只雌性BALB/c小鼠分为对照组(A组)、OVA致敏激发哮喘组(B组)、偏肺病毒哮喘组(C组)、小剂量玉屏风组(D组)、中剂量玉屏风组(E组)、大剂量玉屏风组(F组),采用卵蛋白致敏和激发,hMPV滴鼻方法建立哮喘人偏肺病毒感染模型并给予玉屏风治疗,采用动物体描箱法测定气道反应性;采用支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞分类计数;肺组织病理切片HE染色观察炎性细胞浸润;采用流式细胞术分别测定肺部细胞因子IFNγ-和IL-4、IL-17。结果:(1)随吸入乙酰甲胆碱浓度增加各组气道反应性明显增加,C组比B组气道反应性显著升高(P<0.05);F组气道反应性明显降低,低于C组(P<0.05);(2)各组BALF中白细胞总数及炎症细胞数都比对照组显著升高,C组BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞与B组、F组相比显著升高(P<0.05);(3)各哮喘组的炎症评分都显著高于对照组。在细支气管周围炎、肺泡炎方面B组和F组比C组明显减轻(P<0.05)。(4)A、B组IFNγ-无差异(P>0.05),各剂量组IFNγ-,IFNγ-/IL-4均显著高于B、C组(P<0.05);哮喘组、治疗组IL-4显著高于正常组(P<0.01),但各组间无明显差异;与B组相比,C组IL-17水平明显升高(P<0.05);与C组相比,E、F组IL-17水平明显降低。结论:大剂量玉屏风散可以抑制感染hMPV哮喘小鼠的气道高反应性及气道炎症,且改善Th1/Th2失衡状态。
- 李荣培陈昕刘平陆彪赵晓东
- 关键词：玉屏风散人偏肺病毒哮喘气道反应性
- 绿色荧光蛋白标记重组人偏肺病毒的制备被引量：5
- 2009年
- 目的人偏肺病毒（human metapneumovirus，hMPV）可致人上、下呼吸道感染。研究利用反向遗传学技术，以带绿色荧光蛋白（GFP）标记的hMPV NL／1／00全长cDNA质粒及4种辅助质粒pCITE-N、pCITE—P、pCITE—M2．1和pCITE—L为基础，在体外制备GFP标记的重组hMPV病毒（命名为rhMPV NL／1／00GFP）。方法采用LipofeetAMINE2000将带GFP标记的hMPV NL／1／00全长cDNA质粒以及蛋白表达质粒pCITE—N、pCITE-P、pCITE—M2．1和pCITE—L共转染BSR—T7细胞，3d后取BSR—T7细胞上清液感染Vero—E6细胞，1～4d后观察Vero-E6细胞出现明显细胞病变（CPE）和绿色荧光，持续观察至第10天。收集病毒上清用于病毒滴度检测。提取培养上清的病毒RNA并通过RT—PCR方法扩增病毒N基因、F基因和G基因验证所获重组病毒。结果Vero—E6细胞接种1～4d后观察到明显CPE和绿色荧光，随后CPE加重，荧光信号加强，持续至感染后10d；第1、5、10、15和20代病毒的滴度波动于10^5.0～10^6.5 TCID50／ml；RT—PCR检测出符合预期大小的910bp（N）、450bp（F）和980bp（G）条带，经上述片段cDNA序列测定和比对表明获得的重组病毒与hMPV NL／1／00原型病毒序列一致。rhMPV NL／1／00GFP重组病毒在体外传代20代后，遗传信号和荧光信号均稳定。结论采用反向遗传学技术成功拯救了具有感染性的重组hMPV病毒，为hMPV感染发病机制及疫苗研究奠定了基础。
- 陈昕葛金英步志高赵晓东
- 关键词：反向遗传技术人偏肺病毒病毒拯救细胞病变效应绿色荧光蛋白
- 玉屏风散预防人偏肺病毒感染的实验研究被引量：9
- 2011年
- 目的:人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)是婴幼儿呼吸道感染重要的病毒病原,目前尚无有效预防和治疗药物。本研究探讨玉屏风散对小鼠感染hMPV的保护作用。方法:将40只BALB/c小鼠随机分为5组,实验组经不同剂量玉屏风散灌胃14d后,滴鼻感染荧光标记的重组hMPV。感染后第5天处死小鼠,无菌状态下取肺组织,左肺用于病理切片,RT-PCR法检测hMPV感染;右肺称重,按每克肺组织加入10mL鼠肺组织缓冲液,4℃匀浆,通过改良噬斑形成法检测肺组织匀浆中hMPV滴度。结果:①HE染色提示大剂量玉屏风散组比病毒对照组小鼠肺组织炎症程度显著减轻[病理评分(5.13±0.84)vs(15.25±1.49),P<0.01];②病毒对照组、小剂量组、中剂量组、大剂量组肺内平均病毒滴度分别为(2.33±0.98)×105、(2.08±0.11)×105、(5.08±1.46)×104、(2.17±0.75)×102 PFU/g,中、大剂量组与病毒对照组比较肺内病毒滴度与肺组织病理评分呈正相关(r=0.844,P<0.01)。结论:大剂量玉屏风散预防可显著抑制hMPV在小鼠肺内复制水平,减轻肺组织病理损害。玉屏风散预防病毒感染的机制是以直接抗病毒作用抑或调节机体抗病毒免疫功能为主尚待进一步研究。
- 李荣培余春梅陈昕刘平陆彪赵晓东
- 关键词：玉屏风散人偏肺病毒抗病毒作用病毒复制
