国家自然科学基金(30470523)
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
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- HPV18E6基因沉默对宫颈癌Hela细胞生长和凋亡的影响被引量：2
- 2008年
- 目的:观察RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达对宫颈癌Hela细胞生长和凋亡的影响,探索宫颈癌基因治疗的新途径。方法:针对HPV18E6 mRNA序列合成一对60bp的编码siRNA的DNA模板和一对60bp的非特异性对照DNA模板,构建pSUPER-siRNA和pSUPER-con重组质粒,瞬时转染Hela细胞;采用RT-PCR法检测质粒转染后细胞HPV18E6基因表达的变化,用蛋白免疫印迹法检测转染后Hela细胞p53、p21、Bcl-2和Bax蛋白表达变化,以细胞计数法检测细胞生长情况,Hoechest/PI双荧光活细胞染色法检测细胞凋亡。结果:pSUPER-siRNA质粒转染能有效降低HPV18E6在mRNA水平的表达,转染后48小时,抑制效率达70%以上;转染后细胞p53、p21和Bax蛋白表达显著增加,Bcl-2蛋白表达减少。RNA干扰法沉默HPV18E6基因表达后,Hela细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡率明显增加。结论:pSUPER-siRNA质粒转染可有效抑制HPV18E6在人宫颈癌Hela细胞中的表达,抑制Hela细胞生长并促进其凋亡。以HPV18E6为靶点的RNA干扰技术可望成为宫颈癌基因治疗的新途径。
- 上官文学杨业鹏周梅李五岭
- 关键词：宫颈癌RNA干扰凋亡
- 硝基还原酶/CB1954自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞杀伤效应的实验研究被引量：2
- 2009年
- 目的:体外观察大肠杆菌硝基还原酶/[5-(1-氮丙啶)-2,4-二硝基苯甲酰胺](以下简称NTR/CB1954)自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞的杀伤效应,探索一种新的宫颈癌基因治疗方法。方法:利用PCR技术从Escherichia coli K12的基因组中扩增出编码NTR的基因nfsB,酶切后,连接到真核表达载体pcDNA3上,获得重组载体pcDNA3-nfsB,lipofectamineTM2000脂质体转染法将pcDNA3-nfsB转染Hela细胞,筛选稳定表达细胞株,应用RT-PCR以及SDS-PAGE检测NTR在Hela细胞中的表达,MTT法检测NTR/CB1954对Hela细胞活力的影响,流式细胞术检测亚二倍体细胞率改变,PI/Hoechest33258双染荧光显微镜下观察Hela细胞凋亡率。结果:成功构建了真核表达载体pcDNA3-nfsB,获得稳定表达NTR的Hela细胞株,在mRNA水平以及蛋白水平检测到NTR在Hela细胞中的表达,NTR/CB1954自杀基因系统明显影响Hela细胞的活力,增加了Hela细胞的凋亡率。结论:NTR/CB1954自杀基因系统对Hela细胞在体外通过凋亡产生明显的杀伤效应。
- 滕隔玲杨业鹏李载权周梅李五岭
- 关键词：自杀基因凋亡
- 一种含双歧杆菌种属特异性复制子的新型大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒的构建
- 2010年
- 目前,双歧杆菌的转化是一个技术难题,与大肠杆菌等宿主菌的高转化效率不同,采用普通的原核质粒无法转化双歧杆菌.为此,本文提出双歧杆菌转化对质粒复制子具有"种属特异性"要求,并通过构建含有双歧杆菌特异复制子的新型穿梭质粒,以求解决这一难题.首先从GenBank获取长双歧杆菌隐性质粒pMB1的序列信息,采用Overlap-PCR方法获得其全长DNA,作为拟构建质粒的复制子;继而采用重组技术,将其与pMK4质粒片段(含大肠杆菌复制子pUC和抗氯霉素基因Cat)重组,构建大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒;用电穿孔法将重组质粒转化双歧杆菌,通过观察不同电转参数下的转化效率,选择双歧杆菌转化的最佳条件.结果,成功获得全长1899bp的pMB1复制子并构建成功含有pMB1和pUC双复制子的原核重组质粒,经酶切和测序鉴定正确,命名为pCMB1.以重组质粒成功转化了长双歧杆菌NCC2705和NQ1501,而其它3种野生型双歧杆菌(包括1株长双歧杆菌)未能转化成功.结论:质粒中含有双歧杆菌种属特异的复制子是实现双歧杆菌转化的必要条件;即使是含有特异复制子的质粒也只能转化有限数量种型甚至有限数量种株的双歧杆菌;选择最佳电转化条件能显著提高转化效率.
- 石屹杨业鹏李载权周梅李会娟张志豹李五岭
- 关键词：双歧杆菌复制子穿梭质粒
- γ射线联合HSV-tk/GCV基因治疗系统抗肿瘤体外实验研究被引量：1
- 2005年
- 目的研究γ射线与人单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/丙氧鸟苷(GCV)基因治疗系统联合应用对Lewis肺癌细胞的杀伤作用及其可能机制。方法以脂质体介导法将含HSV-tk基因的真核表达质粒体外转染小鼠Lewis肺癌细胞,建立稳定表达的细胞株;RT-PCR检测细胞tk基因表达;Hoechst33258/PI荧光活染、流式细胞术检测γ射线与HSV-tk/GCV系统单独及联合作用下的细胞凋亡;集落形成法检测细胞存活曲线,反映放射敏感性变化;同时检测旁观者效应及γ射线对该效应的影响。结果HSV-tk/GCV系统对转染基因的Lewis细胞(Lewis-Hytk细胞)具有选择性杀伤作用。γ射线与HSV-tk/GCV系统联合应用可使Lewis-Hytk细胞的凋亡和坏死率显著高于二者单独作用之和。0.1μg/ml GCV可使Lewis-Hytk细胞的放射敏感性明显增高(SER=1.47)。γ射线可增强HSV-tk/GCV系统的旁观者效应,二者联合作用后的Lewis-Hytk细胞的培养液对未处理过的Lewis细胞具有杀伤作用。结论γ射线与HSV-tk/GCV系统联合应用对Lewis肺癌细胞具有协同杀伤效应。γ射线增强HSV-tk/GCV系统的旁观者效应可能是其协同效应产生的机制之一。
- 陈治国杨业鹏周梅占晓海沈剑沈磊李五岭王新娟
- 关键词：Γ射线基因治疗LEWIS肺癌细胞旁观者效应
