国家自然科学基金(31200082)
- 作品数：10 被引量：16H指数：2
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- H7N9流感病毒血凝素HA在毕赤酵母中的表达及免疫原性分析被引量：6
- 2015年
- 目的利用毕赤酵母表达制备H7N9流感病毒血凝素[HA 1-525个氨基酸（aa）],并对其免疫原性进行研究。方法经全基因合成获得H7N9流感病毒[A/Hangzhou/1/2013（H7N9）]全长HA,以其为模板,PCR得到片段HA^1-525,通过NspⅤ和NotⅠ双酶切连入pPICZαA载体,转入毕赤酵母X33,ELISA筛选阳性克隆。发酵培养后,表达上清经PEG20000沉淀获取HA^1-525,并用糖苷内切酶H（endo H）酶切分析其N-糖链。将制备的HA^1-525免疫BALB/c小鼠,经ELISA检测特异性HA7抗体滴度,红细胞凝集抑制实验分析血抑活性。结果培养上清用抗HA7抗体经ELISA检测,重组菌成功表达HA7,且Western印迹检测发现有特异性弥散条带,经endo H酶切后,HA^1-525为均一条带,相对分子质量约58×10^3,与理论大小相当,表明HA^1-525存在甘露糖基化结构。HA^1-525两次免疫小鼠后可产生1∶36 000的抗体滴度。以H7N9裂解苗为抗原,检测其血抑活性为1∶700。结论利用毕赤酵母表达的H7N9流感病毒HA1-525可以诱导小鼠产生针对HA7的中和抗体。
- 王莎唱韶红刘波巩新徐威吴军
- 关键词：血凝素类毕赤酵母
- 过表达N-糖基转移酶的糖基工程酵母构建被引量：2
- 2015年
- 目的通过过表达N-糖基转移酶,构建1株糖基化修饰效率更高的糖基工程酵母。方法利用尿嘧啶(URA3)营养缺陷型筛选标记,在糖基工程酵母4-32中转入醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)启动子控制的利士曼原虫N-糖基转移酶星状孢子素和温度敏感性酶3(staurosporine and temperature sensitivity 3,STT3)D亚基,通过SDS-PAGE、Western印迹和肽N-糖苷酶F(peptide-N-asparigineamidase F,PNGase F)酶切等方法,分析4-32-STT3D表达的抗人表皮生长因子受体2(HER2)抗体(anti-human epidermal growth factor receptor 2)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)N-糖基化程度,并测定STT3D转入和诱导表达对酵母生长情况的影响。结果 SDS-PAGE结果显示,4-32-HL菌表达的抗HER2抗体除有一条相对分子质量约55×103的重链主带外,还有一条约50×103的未糖基化条带。4-32-HL-STT3D菌表达为均一的55×103条带,无50×103条带。PNGase F酶切后,上述重链呈50×103的均一条带。Western印迹证明以上所有条带均为抗体成分。以GM-CSF作为报告蛋白验证STT3D的作用,结果显示,4-32-GM-CSF菌表达的GM-CSF为22×103和20×103的两条带,而4-32-GM-CSF-STT3D表达则为均一的22×103条带。PNGase F酶切4-32-GM-CSF和4-32-GM-CSF-STT3D菌表达的GM-CSF后,GM-CSF呈18×103的均一条带。分别测定STT3D外源基因转入和诱导表达时对酵母生长情况的影响,统计学分析显示,STT3D转入不诱导对酵母生长影响不显著,STT3D诱导表达对酵母生长影响极显著。结论过表达N-糖基转移酶的糖基工程酵母对靶标蛋白具有更高的N-糖基化修饰效率。
- 毛银平巩新唱韶红宋西勇吴军刘波
- 关键词：酵母抗体N-糖基化
- 毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析
- 2016年
- 目的通过毕赤酵母(Pichia pastoris)表达制备重组人凝血酶原2(prothrombin-2),并利用锯鳞蝰(Echis carinatus)凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶,分析凝血酶的活性。方法根据Gen Bank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列,设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体p PICZαA中,转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌,诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2,培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备,并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3.1(+),瞬转HEK 293T细胞,收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应,利用凝血酶发色底物S-2238,测反应产物的酶促活性;利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白,去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103,与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定,纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后,可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺(pNA),且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高;经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结,与凝血酶试剂的血凝时间接近,且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2,被ecarin活化为具有活性的凝血酶,有望替代从血浆中提取的凝血酶原,用于战伤救治和临床研究。
- 樊宇唱韶红巩新刘波吴军
- 关键词：毕赤酵母
- 用大肠杆菌制备O157多糖-菌毛蛋白结合物的研究被引量：2
- 2013年
- 目的以大肠杆菌O157型多糖与菌毛蛋白PilE为模型,在大肠杆菌中重构脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化修饰系统,为建立一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗技术提供基础。方法用Red重组技术敲除大肠杆菌W3110的O抗原连接酶基因waaL,构建CLM24菌株。在该菌株中共表达脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白基因pilE、寡糖转移酶基因pglL,构建O-糖基化修饰系统。分别转化大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL与大肠杆菌O157型多糖表达载体于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,再利用Western印迹检测菌毛蛋白PilE的修饰情况。结果利用抗His-tag单抗进行Western印迹检测,16℃IPTG诱导条件下,转化大肠杆菌鼠李糖转移酶基因wbbL于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,重组菌CLM24/pMMB66EH-pilE-his/pETtac28-wbbL-pglL与其他对照菌相比,不仅在相对分子质量为19×103处有特异性条带,而且在相对分子质量(40～60)×103处也出现了特异的梯状条带;转化大肠杆菌O157的O多糖基因簇克隆载体于构建了O-糖基化修饰系统的大肠杆菌,重组菌CLM24/pMMB66EHpilE-his/pETtac28-pglL/pACYC184-O157用抗O157多抗和抗His-tag单抗进行Western印迹检测,在相对分子质量(40～60)×103处均产生特异的梯状条带。结论在大肠杆菌中重建的O-糖基化修饰系统可以利用自身的O16型O多糖或异源的O157型O多糖修饰菌毛蛋白PilE,获得多糖-蛋白结合物。本研究为建立一步生物交联法制备多糖-蛋白结合疫苗提供了技术基础。
- 徐敏锐孙鹏张部昌刘波吴军
- 关键词：PILE大肠杆菌
- 甲醇-山梨醇混合碳源诱导提高抗HER2抗体在糖基工程毕赤酵母中的表达
- 2013年
- 目的:以抗HER2抗体为模型,研究抗体在糖基工程酵母菌中的表达及工程菌发酵技术。方法:首先通过摇瓶试验分析诱导用甲醇浓度对抗体表达的影响,并用高表达HER2的SK-BR-3细胞分析抗HER2抗体的抗原结合活性。以此为基础,在5 L发酵罐中研究甲醇-山梨醇混合碳源流加诱导对抗HER2抗体表达水平的影响;收集发酵培养液,采用阳离子交换层析对目标产物进行纯化;利用SDS-PAGE、Western印迹、Lowry法对抗体的相对分子质量、浓度等进行分析。结果:摇瓶试验结果表明,甲醇浓度为0.5%时抗体表达量最高,且糖基工程毕赤酵母菌表达的抗HER2抗体具有与SK-BR-3细胞抗原结合的活性;在5 L发酵罐中,利用甲醇和山梨醇混合诱导方式发酵表达抗体,其表达量可提高至0.6 g/L,比摇瓶诱导表达的抗体产量提高了近10倍;非还原SDS-PAGE及Western印迹表明抗体相对分子质量为1.5×105,与商业化抗体Herceptin的大小一致;经过一步阳离子交换层析纯化,纯化后抗体浓度为0.365 g/L。结论:采用甲醇-山梨醇混合碳源诱导方式在5 L发酵罐中进行发酵表达,能够提高抗HER2抗体在糖基工程酵母菌中的表达量,本研究可为抗体在酵母中的规模发酵技术提供重要参考。
- 高爱荣刘波唱韶红巩新徐敏锐徐威吴军
- 关键词：毕赤酵母发酵
- 重组小鼠血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和纯化
- 2012年
- 目的:建立毕赤酵母重组小鼠血管内皮生长因子(mVEGF)的制备方法,为研究mVEGF的生物活性、抗原性等提供基础。方法:通过全基因合成方法获得编码mVEGF的基因片段,将其克隆至表达载体pPICZαA上,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,用甲醇诱导表达目的蛋白,表达上清经硫酸铵沉淀、Sephadex G25柱脱盐、阳离子交换层析三步纯化获得目的蛋白;用还原型和非还原型SDS-PAGE检测目的蛋白的聚体状态,用Western印迹验证纯化蛋白;通过PNGase F酶切分析目的蛋白的N-糖基化修饰;通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验检测目的蛋白的生物活性。结果:获得mVEGF的重组毕赤酵母表达菌株,SDS-PAGE分析可见GS115表达的重组mVEGF在还原状态下表观相对分子质量约为20×103,在非还原状态下约为40×103;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,能被兔抗mVEGF抗体特异性结合,PNGase F酶切后相对分子质量降至18×103左右,证明目的蛋白发生了N-糖基化修饰;细胞测活实验表明,mVEGF具有刺激HUVEC增殖的生物活性。结论:利用毕赤酵母菌制备了具有生物活性的重组mVEGF。
- 李海燕刘波唱韶红巩新徐威吴军
- 关键词：毕赤酵母重组蛋白N-糖基化
- 拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ和人N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的原核表达及其多克隆抗体制备
- 2012年
- 目的:在大肠杆菌中分别重组表达拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ(ATMDSI)和人N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(HsGnTI),制备其多克隆抗体,为基因表达鉴定提供检测抗体。方法:用PCR方法克隆ATMDSI、HsGnTI基因片段,连接至pBV220表达载体后转化大肠杆菌DH5α,获得表达菌株,通过42℃升温诱导表达,制备纯化ATMDSI和HsGnTI;纯化的蛋白以80μg/kg的剂量免疫大耳白兔,经3次免疫后,采集血清制备其相应的多克隆抗体;采用Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果:获得ATMDSI和HsGnTI基因片段,并构建了其相应的原核表达载体pBV220-ATMDSI、pBV220-HsGnTI,在大肠杆菌中表达了重组ATMDSI和HsGnTI,SDS-PAGE分析显示其相对分子质量分别为45.3×103和46.9×103,与理论值一致;用纯化的蛋白免疫大耳白兔后制备了抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体,Western印迹结果证明该抗体具有较高的特异性。结论:获得了特异性较高的抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体血清,为甘露糖苷酶Ⅰ和N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的研究提供了检测抗体。
- 胡晓巩新唱韶红何建勇吴军刘波
- 关键词：原核表达多克隆抗体
- Endo-H在毕赤酵母中的表达、纯化及其在N-糖基化分析中的应用被引量：5
- 2014年
- 目的通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H(endo-beta-N-acetylglucosaminidase H,Endo-H),并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌(Streptomyces plicatus)Endo-H的cDNA序列,设计并合成Endo-H全基因,将其克隆至P.pastoris表达载体pPIC9中,重组质粒转化P.pastoris JC308宿主菌,工程菌经甲醇诱导,分泌表达Endo-H,目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后,纯度可>95%。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳(DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis,DSA-FACE)分析核糖核酸酶B(ribonuclease B,RNaseB)的糖基结构,比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F(peptide-N-asparigine amidase F,PNGase F)的糖基切割功能。结果利用P.pastoris表达制备EndoH,可切割天然或变性状态下的β-1,4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链,不能切割复杂型糖链糖蛋白;经DSAFACE分析,结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5GlcNAc-Man9GlcNAc,PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5GlcNAc2-Man9GlcNAc2,两者相差一个GlcNAc。结论通过P.pastoris制备的Endo-H具有天然生物活性,可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。
- 支艳艳唱韶红巩新宋西勇吴军刘波
- 关键词：毕赤酵母N-糖基化
- 长效人白细胞介素4拮抗剂的研究
- 2014年
- 目的研制保留白细胞介素4受体(IL-4R)结合能力,但不具有激活下游信号活性的人白细胞介素4(IL-4)突变体M5,并通过抗体Fc融合延长其体内半衰期,为变态反应病药物研发提供基础。方法全基因合成人IL-4突变体M5,将其克隆到p BV220表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达M5蛋白。同时构建嵌合基因M5-Ig G1Fc,并克隆到p PICZαA载体中,电转化糖基工程毕赤酵母GJK01,经甲醇诱导,分泌表达M5-Ig G1Fc融合蛋白。利用CTLL-2/IL-4R细胞测定纯化所得M5蛋白、M5-Ig G1Fc融合蛋白的IL-4拮抗活性,最后利用ELISA试剂盒检测比较两者在小鼠体内的清除速度。结果由大肠杆菌DH5α表达的M5蛋白和糖基工程酵母GJK01表达的M5-Ig G1Fc融合蛋白都具有IL-4拮抗活性,它们在CTLL-2/IL-4R细胞上拮抗IL-4(5.6×10-2nmol/ml)的EC50分别为(0.31±0.05)和(0.77±0.03)nmol/ml。小鼠体内M5蛋白在注射后0.5 h时达峰,其在血液中的含量为5.8×10-2nmol/ml,而在2 h时血药浓度已下降为峰值的2.8%,在8 h时低于ELISA试剂盒的检测限。M5-Ig G1Fc融合蛋白在注射后0.5 h时血液中浓度也达到峰值,为4.7×10-2nmol/ml,120 h时其血药浓度下降为峰值的4.3%,而168 h时低于ELISA试剂盒的检测限。结论 M5蛋白具有IL-4拮抗作用。由糖基工程酵母表达的M5-Ig G1Fc融合蛋白不仅具有IL-4拮抗活性,而且在小鼠体内具有较长的半衰期,为下一步将其研发为治疗变态反应病的药物提供了理论基础。
- 宋西勇唱韶红刘波巩新吴军
- 关键词：白细胞介素4拮抗剂毕赤酵母融合蛋白半衰期
- 糖基工程酵母表面呈现抗体库的构建及抗真菌β甘露糖型抗体的筛选被引量：1
- 2016年
- 目的:通过构建糖基工程酵母表面呈现免疫抗体库,筛选与毕赤酵母表达的禽流感血凝素HA7结合的特异性抗体。方法:利用糖基工程毕赤酵母细胞膜锚定蛋白Sed将人Ig G的Fc段锚定在酵母表面,然后用毕赤酵母表达的HA7免疫小鼠,从小鼠脾脏细胞中扩增抗体轻重链可变区基因构建抗体转化锚定了Fc的糖基工程酵母,构建表面展示免疫抗体库,通过免疫磁珠法筛选与毕赤酵母表达的HA7特异性结合的抗体表达酵母,分析筛选该抗体的特异性结合靶点。结果:构建了多态性良好的抗体表达质粒库,转化糖基工程酵母后筛选得到特异性结合HA7的抗体呈现酵母,Western印迹分析发现该抗体只与糖基化的HA7结合而不与切除糖链后的HA7结合,说明抗体结合区域在HA7的糖链上,进一步实验发现该抗体不与α甘露糖型和哺乳动物复杂型糖型结合,通过β甘露糖苷酶切研究发现抗体结合靶点为酵母表达HA7糖链上的β甘露糖。结论:利用糖基工程酵母构建抗体库,筛选得获得了抗真菌β甘露糖的抗体,动物实验发现抗体具有中和活性。
- 房泽轩刘波巩新唱韶红吴军
- 关键词：中和活性
