国家自然科学基金(30371661)
- 作品数：12 被引量：38H指数：3
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- 血清核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)含量测定及其临床意义初探被引量：3
- 2004年
- [目的]研究血清核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)含量与白血病的相关性,探讨血清NDPK-A含量检测对于白血病早期诊断和疗效判断意义。[方法]应用重组人NDPK-A及相应抗体建立双抗体夹心ELISA测定NDPK-A含量方法,应用此方法测定正常人和血液病患者血清NDPK-A含量。[结果]20例正常人血清NDPK-A含量为3.89±0.39μg/L,16例白血病患者血清NDPK-A含量为11.06±18.03μg/L,5例骨髓瘤患者患者血清NDPK-A含量为4.80±0.96μg/L,5例淋巴瘤患者血清NDPK-A含量为24.31±5.65μg/L。白血病患者治疗前后血清NDPK-A含量差异显著,7例治疗前患者NDPK-A含量为16.23±26.61g/L,治疗后患者NDPK-A含量为7.05±6.10g/L。[结论]建立的ELISA方法简单,灵敏、准确地测定血清NDPK-A含量;NDPK-A含量检测可发展为白血病的早期诊断和疗效判断指标。
- 熊盛李雪玲王一飞李冰张美英罗更新朱康儿
- 关键词：血清白血病患者白血病疗效判断双抗体夹心ELISAELISA方法
- pQE-hbFGF表达系统的构建及其蛋白质的表达和纯化
- 2005年
- 目的 构建pQE hishbFGF表达载体 ,通过一步纯化得到 6×HishbFGF蛋白质。方法 用PCR扩增目的基因hbFGF ,连接到pQE4 0载体上 ,转化到Top10菌株筛选重组子 ,经测序后将质粒转化到表达菌M15上 ,经IPTG诱导表达 ,超声波破菌后通过镍离子螯合层析一步纯化得 6×HishbFGF蛋白质 ,ELISA鉴定产物 ,用MTT法检测产物促细胞增殖的生物活性。结果 hbFGF基因插入pQE载体中 ,在M15中 6×HishbFGF的表达量达到 2 0 % ,且为可溶性表达。经一步纯化后得到N端带 6个组氨酸的hbFGF蛋白 ,纯度为 96 % ,6×HishbFGF具有免疫原性及促进NIH3T3细胞增殖的活性。结论 6×HishbFGF蛋白质在M15中可溶性地高效表达 ,并经一步亲和层析得到纯度高活性高的产物 ,降低了生产成本 。
- 刘秋英王一飞熊盛胡红梅钱垂文张美英冉延超袁茵吴志聪
- 关键词：人碱性成纤维细胞生长因子可溶性表达
- 重组人抑癌相关蛋白核苷二磷酸激酶A的原核表达被引量：3
- 2004年
- 目的 :为提高表达量 ,简化纯化工艺 ,获得可用于临床研究的重组人NDPK -A蛋白 ,构建带有 6×His纯化标签的原核表达载体 ,优化表达条件获得产物高表达并鉴定产物活性。方法 :将抑癌基因nm2 3-H1从质粒pBVNMH1中亚克隆于带有纯化标签的表达载体pQE4 0中 ;梯度变化表达条件获得产物高表达 ;镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白 ;Westernblot鉴定产物的免疫原性 ;HPLC测定产物的激酶活性 ;鸡胚尿囊膜试验鉴定产物抑制血管新生的生物活性。结果 :pQE - 4 0中亚克隆的nm2 3-H1序列无误 ;目的蛋白最高表达量可达 4 9 6 % ;纯化的表达产物能与天然NDPK -A的多克隆抗体特异结合 ;酶比活为 4 72U/mg ;具有抑制鸡胚尿囊膜血管新生的活性。结论 :表达质粒pQE -nm2 3H1能高效表达重组人NDPK -A ,纯化工艺简便 ,产物活性与天然NDPK -A无异。
- 冉延超王一飞熊盛张美英黄文韬罗林波刘秋英
- 关键词：核苷二磷酸激酶肿瘤抑制蛋白质类
- 肿瘤转移抑制基因nm23-H1在人肺癌细胞的表达及其检测被引量：1
- 2005年
- 目的:选择已分离鉴定的人巨细胞肺癌细胞高转移亚型PGBE1,转染肿瘤转移抑制基因nm23-H1,以获得稳定表达nm23-H1基因的人肺癌细胞株。方法:采用亚克隆方法获得pcDNA3.1(-)/nm23-H1真核表达载体并进行双酶切和测序鉴定;应用脂质体转染法将重组质粒转染PGBE1细胞;用G418筛选获得阳性细胞克隆,命名为pcDNA3.1(-)/nm23-H1-PGBE1细胞株;用RT-PCR法半定量检测nm23-H1基因的mRNA表达水平和免疫组化法检测nm23-H1基因的蛋白质表达。结果:真核表达载体pcDNA3.1(-)中正确插入了具有完整阅读框的nm23-H1基因;倒置显微镜下观察到经G418筛选出的稳定转染的PGBE1细胞,形成“小岛”;RT-PCR和免疫组化显示转染的细胞中nm23-H1mRNA和蛋白质水平表达均增高。结论:建立了稳定表达nm23-H1基因的PGBE1转染细胞株,可用于进一步研究肿瘤转移的分子机制。
- 胡红梅王一飞张美英刘秋英袁茵钱垂文
- 关键词：NM23-H1真核表达载体转染
- siRNA分析nm23-H1基因与人慢性髓性白血病的关系被引量：3
- 2006年
- 设计并筛选靶向nm23-H1基因的siRNAs序列,探讨nm23-H1基因与人慢性髓性白血病之间的关系。依据siRNA设计原则,设计3条siRNA序列。将不同靶点的siRNA用lipofectamine2000转染人慢性髓性白血病细胞株K562。转染后24h RTPCR检测nm23-H1mRNA水平变化;转染后48h免疫细胞化学法检测nm23-H1蛋白表达。MTT法检测转染后24h、48h和72h有效siRNA对K562细胞生长的影响。3条siRNA中,siNM526能有效地抑制K562细胞nm23-H1基因表达,转染siNM526的K56细胞生长受到抑制。说明下调nm23-H1基因的表达有抑制K562细胞增殖的作用,即降低了K562细胞的恶性程度。nm23-H基因有可能成为白血病治疗潜在的分子靶点。
- 陈宇霞张美英熊盛钱垂文王一飞
- 关键词：K562细胞
- 人脐静脉血管内皮细胞的体外培养及rhNDPK-A对其增殖的作用被引量：2
- 2005年
- 目的建立一种体外培养人脐静脉血管内皮细胞的方法,初步探讨rhNDPK-A蛋白对内皮细胞生长的影响。方法采用胶原酶对新生儿脐带静脉血管进行消化,从中分离出血管内皮细胞,体外传代培养,通过MTS/PMS法测定不同浓度的rhNDPK-A蛋白对HUVEC体外增殖的影响。结果成功获得体外培养的人脐静脉血管内皮细胞,从0 0610μg/ml到250μg/ml的rhNDPK-A蛋白对人脐静脉血管内皮细胞的增殖既没有抑制也没有促进作用。结论建立了分离培养人脐静脉血管内皮细胞的方法,rhNDPK-A蛋白不是通过抑制内皮血管细胞的增殖而抑制血管新生的。
- 刘秋英张美英罗新李耘邢少璟王一飞胡红梅
- 关键词：人脐静脉血管内皮细胞体外培养增殖HUVEC内皮细胞生长脐带静脉
- 重组抗HBsAg单链抗体在HBV转基因小鼠体内作用的研究
- 2004年
- 目的 研究重组人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)在HBV转基因小鼠体内的活性作用 ,探讨HBV转基因小鼠作为HBsAg特异性抗体的结合活性评价模型的可行性。方法 工程菌表达的HBscFv包涵体经固定化金属螯合层析和分子排阻层析两步纯化后 ,分步透析复性。复性后的HBscFv(0 .9g L)经尾静脉注射HBV转基因小鼠 ,一定时间后测定鼠血清中HBsAg的浓度 ,计算抗体注射前后HBsAg浓度下降的百分比 (结合率 ) ,同时以人血源HBsAbIgG(40U ml)和生理盐水作为对照。结果 两步纯化获得纯度达到 98%的重组HBscFv。HBscFv制品能够结合转基因小鼠体内的HBsAg,其结合率为 (30 .4 7± 9.85 ) % ,与生理盐水组差异有显著性 (P <0 .0 0 1) ,与HBsAbIgG组差异无显著性(P >0 .0 5 ) ;对照品HBsAbIgG的结合率为 (39.0 0± 7.4 3) % ,与生理盐水组差异也有显著性 (P <0 .0 0 1)。比较HBscFv和HBsAbIgG的结合率及其浓度 ,求得HBscFv的结合效价为 31.5 8U mg。结论 HBscFv在转基因小鼠体内具有特异性结合HBsAg活性 ,HBV转基因小鼠可发展为评价HBsAg特异性抗体的体内结合活性的候选模型。
- 熊盛王一飞邢少璟邓宁张美英陈文吟饶桂荣粟宽源余宙耀
- 关键词：HBV转基因小鼠乙肝病毒菌株
- nm23-H1基因对人肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的抑制作用被引量：9
- 2006年
- 目的:研究转染nm23-H1基因对体外培养A549细胞增殖和侵袭的抑制作用及其机理。方法:构建nm23-H1基因的真核表达载体,转染到体外培养的人肺腺癌细胞A549中,通过G418筛选出稳定表达克隆,RT-PCR及免疫组化检测nm23-H1在细胞内的表达情况。绘制细胞生长曲线检测nm23-H1基因对细胞生长的影响,流式细胞仪检测细胞周期,原子力显微镜观察细胞膜表面伪足的超微结构。结果:转染后的肿瘤细胞能稳定表达nm23-H1基因,抑制了肿瘤细胞的增殖。nm23-H1基因没有诱导细胞凋亡但使G1期细胞增加而S期细胞减少,停滞于G0期。转染nm23-H1基因后细胞边缘的伪足减少。结论:nm23-H1基因能抑制体外培养的A549肿瘤细胞的增殖,可能通过改变细胞表面结构减弱细胞的侵袭能力。
- 刘秋英吴志聪胡红梅熊盛张美英袁茵刘美莉王一飞
- 关键词：肿瘤侵袭肺肿瘤A549细胞
- nm23-H1基因与人早幼粒白血病细胞HL-60增殖的相关性分析被引量：3
- 2004年
- 目的 :探讨nm2 3-H1基因的表达与白血病细胞HL - 6 0增殖之间的关系。方法 :以 2 5ng/mL阿糖胞苷处理HL - 6 0细胞 ,MTT法测定细胞生长抑制率 ,NBT还原比色法判断细胞分化状况 ,RT -PCR检测nm2 3-H1基因表达的变化 ;构建nm2 3-H1基因的真核表达质粒pEGFP -N1-nm2 3-H1,转染HL - 6 0细胞 ,通过细胞生长曲线和血清依赖性实验检测nm2 3-H1基因的过表达对HL - 6 0细胞生长的影响。结果 :小剂量Ara -C对HL - 6 0细胞的生长呈时间依赖性抑制 ,作用4d后细胞NBT还原能力增强且nm2 3-H1基因的表达下调 ;转染nm2 3-H1基因的HL - 6 0细胞生长加快、血清依赖性下降。结论 :Ara -C对HL - 6 0细胞增殖的抑制作用与下调nm2 3-H1基因的表达有一定关系 ;nm2 3-H1基因在HL - 6 0细胞中的过表达有促细胞增殖的作用 ,即增高了HL -6
- 袁茵王一飞张美英熊盛李久香胡红梅刘秋英吴志聪
- 关键词：NM23-H1基因HL-60细胞细胞增殖
- 表皮生长因子间接竞争酶联免疫吸附测定法的建立被引量：14
- 2003年
- 目的:建立一种可应用于临床的快速定量测定表皮生长因子含量的酶联免疫吸附测定法(ELISA)。方法:以重组人表皮生长因子(EGF)为包被抗原和竞争抗原,两者与一定量的EGF抗血清反应,建立检测EGF的间接竞争ELISA方法。结果:理想的包被抗原质量浓度为1μg/mL,EGF抗血清的工作浓度为1∶10000,酶标二抗工作浓度为1∶3000,可测最适范围为0 5～16ng/mL,最小检测量为0 5ng/mL,批内和批间变异系数分别为6 21%和7 42%。得到回归方程y=-13 65ln(x)+81 554,相关系数R2=0 997。结论:建立了快速定量检测EGF的间接竞争ELISA方法。
- 李雪玲吴学诗赖锦昌李冰张美英夏勇王一飞
- 关键词：表皮生长因子间接竞争ELISA
