国家自然科学基金(30460090)
- 作品数：18 被引量：46H指数：4
- 相关作者：石德顺杨素芳冯贵雪卞桂华陆凤花更多>>
- 相关机构：广西大学扬州大学江苏农牧科技职业学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划广西省自然科学基金更多>>
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- 禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达被引量：4
- 2009年
- 【目的】分离用于禽源细胞中表达短干扰RNA(short interference RNA,siRNA)的禽U6启动子。【方法】以鸡基因组为模板进行PCR扩增,将扩增产物进行序列测定和生物信息学分析,并将其插入报告基因载体pEGFP-N1中,获得siRNA表达载体pGFP-U6,将由软件预测针对GFP基因的siRNA所对应的shRNA(short hairpin RNA)插入其中,获得pGFP-U6-shRNA;以含人H1启动子的siRNA表达载体pGFP-H1-shRNA为对照,分别转染COS-1和DF-1细胞,用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染细胞培养中GFP阳性细胞数和荧光总量。【结果】克隆的U6启动子位于鸡28号染色体,与发表的鸡U6-3启动子同源性为97.2%,含多个Oct-1序列,不含CACCC框、SPH和PSE等聚合酶Ⅲ启动子序列,TA框不典型;在pGFP-U6-shRNA转染的哺乳动物源COS-1细胞培养中,GFP阳性细胞数和荧光总量均有所下降,但不如pGFP-H1-shRNA转染细胞显著;在pGFP-U6-shRNA转染的禽源DF-1细胞培养中,不仅GFP阳性细胞数和荧光总量显著下降,而且基因沉默效果显著优于pGFP-H1-shRNA转染细胞。【结论】成功克隆的禽U6启动子不仅能有效转录siRNA,而且转录活性具有相对的细胞种属特异性。
- 王永娟沈鹏鹏张鑫宇夏晓莉孙怀昌
- 关键词：克隆转录活性
- SYBR Green实时荧光定量PCR检测水牛体细胞组蛋白乙酰化相关基因mRNA表达被引量：9
- 2009年
- 以检测水牛成纤维细胞中组蛋白乙酰转移酶(HAT1)和脱乙酰化酶(HDAC1)转录活性为例,对SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台的建立进行了探讨。结果显示,适宜的引物,高质量RNA反转录得到的cDNA以及合适的PCR体系为SYBR Green实时荧光定量PCR能否成功的关键因素。本试验中3对引物的灵敏度高,其反应性能完全满足SYBR Green实时荧光定量PCR的要求。2个目的基因HAT1、HDAC1的扩增效率与参照基因H2A接近,试验结果可用2-△△Ct计算法进行分析。当cDNA模板量为0.5μL(相当于总RNA 50 ng),引物为1μmol/L时,SYBR Green实时荧光定量PCR能高效获得特异性强的目的产物。
- 罗婵王志强公方强石德顺
- 关键词：实时荧光定量PCR
- 水牛精子提取物对猪卵母细胞的孤雌激活效果
- 2010年
- 为验证精子蛋白对卵母细胞的激活效果,为提高核移植胚胎的质量提供可行方法,通过比较不同裂解方法提取的水牛精子蛋白,不同浓度提取液显微注入猪卵母细胞,对水牛精子提取物的孤雌激活效果进行研究。结果表明:采用液氮反复冻融法和超声波破碎法预处理后提取的水牛精子提取物对猪体外成熟卵母细胞都有显著的孤雌激活效果。水牛精子蛋白浓度在0.53～5.52 mg/mL,注射剂量为2～4 pL时均可有效激活猪卵母细胞,综合效果以1.77 mg/mL较佳。
- 谭世俭谢忠君石德顺谢体三黄章虎
- 关键词：卵母细胞显微注射孤雌激活水牛
- 水牛腔前卵泡的体外培养方法
- 2009年
- 本研究旨在建立一套适合水牛腔前卵泡体外生长发育的培养体系。取用来自本地屠宰场的中国沼泽型水牛卵巢,采用梳刮法回收腔前卵泡,以M cCoy s 5 a作为基础培养液,分别用微孔板培养法、二维培养法、三维培养法进行体外培养。结果表明:不同培养方法对水牛腔前卵泡的体外发育能力有显著差异。培养至10 d,三维培养法的卵泡存活率显著高于微孔板培养法和二维培养法的卵泡存活率(65.05%vs 33.08%,49.52%,P<0.05);二维培养法的卵泡成腔率为1.91%(2/105),三维培养法的卵泡成腔率为1.94%(2/103),而微孔培养法的卵泡未发现成腔;三维培养法的卵泡直径平均增长显著高于微孔板培养法和二维培养法的卵泡直径增长(13.03±5.37μm vs7.53±2.26μm,10.27±4.24μm,P<0.05)。由此可见,三维培养法是水牛腔前卵泡的有效体外培养方法。
- 潘红平陈会娟石德顺陆凤花冯贵雪
- 关键词：水牛腔前卵泡体外培养
- 猪精子提取物对猪卵母细胞的孤雌激活效果
- 2009年
- 3个试验分别就猪精子提取物提取方法、精子蛋白质量浓度以及显微注射剂量对猪卵母细胞的孤雌激活效果进行了研究.结果表明,采用液氮反复冻融法和超声波破碎法提取的猪精子提取物对猪卵母细胞都有显著的孤雌激活效果;采用猪精子提取物显微注射孤雌激活猪卵母细胞的适宜注射剂量为2-4 pL;猪精子蛋白质量浓度在1.35 mg/mL以上,注射剂量为2-4 pL时均可有效激活猪卵母细胞.
- 谭世俭谢忠君石德顺谢体三李辉邓彦飞刘继龙
- 关键词：卵母细胞显微注射孤雌激活
- 水牛卵母细胞去核方法的比较被引量：7
- 2006年
- 水牛卵母细胞体外成熟22 h后,分别用盲吸法、点击法和纺锤体成像系统(Spindleview System)去核。结果,三者的去核率分别为65．1％、81．8％和95．0％,差异极显著(P< 0．01)。以水牛胎儿成纤维细胞为供体,通过核移植构建的重构胚的融合率、分裂率和囊胚发育率, 在上述3种方法之间均没有显著差异(P>0．05)。认为点击法是一种较为简单、实用和有效的去核方法。
- 陈自洪杨素芳谢英李日聪韦精卫石德顺
- 关键词：水牛卵母细胞去核核移植
- 水牛体细胞核移植相关影响因素的研究
- 2008年
- 主要是探讨水牛卵母细胞的体外成熟与供体的年龄和性别对其核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞，在含有5μg／mL细胞松弛素的操作液中进行去核，然后将经0．1μg／mL蚜栖菌素（Aphidicolin，APD）培养处理24h，再用0．5％胎牛血清（FBS）培养2d的水牛耳皮成纤维细胞注射到去核的卵母细胞卵周隙中，再经电融合形成重构胚。重构胚经5μmol／L离子霉素激活处理5min并在2mmol／L的二甲氨基嘌呤（6-DMAP）中培养3h后，在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中（30μL）培养7d，观察其卵裂和胚胎发育情况。结果显示：在添加有10ng／mL上皮生长因子（EGF）成熟液中培养的受体水牛卵母细胞的融合率和重组胚卵裂率与对照组无显著差异（P〉0．05），但其囊胚发育率明显高于对照组（18．53％vs．7．56％，P〈0．05）。来自胎儿（3个月）或成年（一头5～6岁，另一头22岁）水牛的耳皮成纤维细胞核移植后重组胚的卵裂率差异不显著（P〉0．05），但水牛胎儿体细胞构建的重组胚囊胚率显著高于成年体细胞（22．55％vs．10．77％和8．09％，P〈0．05）。雌性水牛成纤维细胞构建的重组胚的囊胚发育率（20．23％）显著高于雄性水牛体细胞的囊胚率（10．16％，P〈0．05）。以上结果表明：（1）成熟液中添加EGF能提高受体卵母细胞核移植后的胚胎发育率；（2）水牛体细胞核移植效果受供体的个体年龄和性别的影响：胎儿成纤维细胞的核移植效果优于成年的成纤维细胞，而且以雌性的效果较好。
- 陆凤花石德顺韦英明潘红平黄凤玲谭世俭王晓丽黄雅琼
- 关键词：水牛核移植成纤维细胞卵母细胞胚胎
- 水牛腔前卵泡的分布及形态学研究被引量：3
- 2007年
- 用常规石蜡切片法研究水牛卵泡在卵巢中的分布规律与结构特征。结果表明：各级卵泡的分布具有明显的区域性；原始卵泡位于卵巢皮质的最外层，形成原始卵泡层，初级卵泡位于皮质的中层，次级卵泡位于富含血管的皮质最内层；原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的直径分别为（36．9±7．7）μm、（48．7±8．9）μm和（91．9±27．3）μm，与之对应卵母细胞的直径分别为（19．6±6．0）μm、（27．3±7．1）μm和（49．1±17．4）μm；原始卵泡和初级卵泡的颗粒细胞数为（10．8±2．3）个和（18．1±3．1）个；次级卵泡含有2～6层颗粒细胞，2～4层的颗粒细胞分布不均。
- 冯贵雪杨素芳石德顺潘红平
- 关键词：水牛腔前卵泡形态学
- 水牛原始生殖细胞(PGCs)的分离培养及生物学特性的研究
- 2006年
- 以水牛胎儿为材料，从生殖腺中分离培养出牛原始生殖细胞，并对水牛原始生殖细胞的分离与克隆的影响因素进行了探讨。结果发现：（1）分离培养出的原生殖细胞（PGCs）呈集落状生长．细胞堆积密集，细胞之间界限不清．细胞与周围的成纤维细胞界限明显；未分化的细胞表达碱性磷酸酶（AKP）以及Oct-4转录因子；（2）收集妊娠29～100d牛胎3L28例，从生殖嵴（腺）或类似物中分离克隆水牛PGCs，23例出现PGCs细胞集落。其中胎龄小于45d（〈3．0cm）和45～55d（3．0～5．ocm）各7例，全部出现PGCs细胞集落；55～70d（5．0～9．0cm）9例，有7例出现PGCs细胞集落，大于70d的5例，有2例出现出现PGCs细胞集落。结果表明，水牛原生殖细胞具有多能性特性，胎龄小于55d的水牛胎儿易于分离培养形成PGCs集落。
- 李童黄奔杨素芳石德顺
- 关键词：水牛原始生殖细胞生物学特性
- 表皮生长因子对水牛卵母细胞体外培养核质成熟的影响被引量：8
- 2007年
- 为了探讨表皮生长因子（EGF）对水牛卵泡卵母细胞体外培养核质成熟的影响，在以TCM199为基础的成熟液中加入不同浓度的EGF（0、10、25、50、100ng／ml），体外成熟培养24-26h，观察第一极体（PB1）的排放；随后进行孤雌激活检测其分裂率、囊胚发育率、囊胚孵化率，并用Hoechst33342染色后计算囊胚的细胞数。结果发现添加EGF各组的卵母细胞第一极体排放率显著提高（P〈0．05）；成熟液中添加25ng／ml EGF时，卵裂率及囊胚发育率（分别为80．0％、44．8％）明显高于对照组（分别为69．3％、31．9％，P〈0．05），但对囊胚的细胞数影响不大。EGF不仅促进水牛卵母细胞体外培养的核成熟，而且有利于卵母细胞的胞质成熟，其中EGF的最佳浓度为25ng／ml。
- 冯贵雪卞桂华王晓丽石德顺
- 关键词：EGF水牛卵母细胞体外成熟
