湖北省自然科学基金(2006ABA137)
- 作品数：2 被引量：0H指数：0
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- 潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达
- 2007年
- 目的:采用基因工程技术,将转化生长因子β前体相关蛋白(LAP)通过基质金属蛋白酶(MMP)水解部位与人可溶性TNFⅠ型受体(hsTNFRⅠ)连接,构建pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白真核表达载体,获得LAP-MMP-hsTNFRⅠ融合蛋白。方法:将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3.1(+),得到pcDNA3.1/MMP重组体;将TGF-β1的LAP段和hsTNFRⅠ与MMP水解部位连接,获得pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ真核表达载体。测序鉴定后,脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果:酶切及测序结果证实pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ重组载体构建成功,转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论:成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3.1/LAP-MMP-hsTNFRⅠ,并获得融合基因的瞬时表达,为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。
- 胡沙熊宙芳梁铭霖黄勇王泽华
- 关键词：基质金属蛋白酶融合蛋白
- 潜伏活性的可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅰ靶向治疗子宫内膜异位症的实验研究
- 2010年
- 目的构建LAP—MMP—hsTNFR Ⅰ-pcDNA3．1融合蛋白真核表达载体，检测融合蛋白的潜伏活性。方法将编码MMP分解部位的DNA序列经基因重组定向克隆至真核表达载体pcDNA3．1中，并将TGF—β1的LAP段和人可溶性肿瘤坏死因子受体（hsTNFR）Ⅰ分别与MMP分解部位的N端和C端连接，构建LAP-MMP—hsTNFRⅠ—pcDNA3．1真核表达载体。经测序鉴定后转染COS-7细胞，通过RT—PCR及免疫印迹检测融合蛋白LAP—MMP—hsTNFRⅠ的表达。在融合蛋白被MMP或子宫内膜异位症患者腹腔液孵育的前后，用MTF法检测其对TNF-α细胞毒效应的抑制活性。结果成功构建了LAP—MMP—hsTNFRⅠ—pcDNA3．1重组载体，并在COS-7细胞得到了有效表达。生物学活性检测表明重组质粒LAP—MMP-hsTNFRⅠ转染组与空载体转染组的L929细胞死亡率差异无统计学意义（P〉0．05）。但在800ng／L肿瘤坏死因子（TNF）-α作用下，重组质粒转染上清与MMP和子宫内膜异位症患者的腹腔液孵育后，L929细胞死亡率分别为（44．5±2．4）％和（33．8±1．9）％，显著低于孵育前（58．1±2．4）％，（P〈0．05）。结论LAP—MMP-hsTNFRⅠ重组融合蛋白的生物学活性可被LAP有效潜伏，并可被MMP和子宫内膜异位症患者的腹腔液激活，可应用于子宫内膜异位症的局部靶向治疗。
- 熊宙芳胡沙王泽华
- 关键词：受体肿瘤坏死因子子宫内膜异位症
