北京市科委重大项目(D0906003000091)
- 作品数：6 被引量：10H指数：2
- 相关作者：吴昊马雪梅陈德喜柳雅立石英更多>>
- 相关机构：首都医科大学附属北京佑安医院北京工业大学军事医学科学院更多>>
- 发文基金：北京市科委重大项目国家自然科学基金北京市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的原核表达纯化及其生物学活性
- 2008年
- 利用基因重组技术及简易的纯化方法快速制备莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV-RT)。设计带有酶切位点的引物,PCR获得MMLV-rt基因片段;再通过定点突变将目的基因的五个可溶性位点进行突变,测序正确后,插入到表达载体pET15b中构建成重组表达质粒pET15b-MMLV-rt;表达产物的纯品通过金属离子(Ni3+)配体亲和纯化系统得到。用SDS-PAGE分析所纯化产物的大小和纯度,再用RT-PCR对其活性进行鉴定。构建的重组表达质粒pET15b-MMLV-rt经IPTG诱导得到N端带有6His的RT融合蛋白,通过Ni3+的亲和层析得到纯品蛋白,SDS-PAGE分析表明其纯度可达96%,RT-PCR实验表明具有较高的生物学活性。由此得出利用原核表达及简易的纯化系统可获得纯度为96%的逆转录酶纯品,为大规模生产该酶提供了可靠的保证。
- 王贤松马雪梅孙一
- 关键词：逆转录酶定点突变酶活力
- 47例汉族HIV／AIDS患者外周血白细胞线粒体DNA高变1区序列分析被引量：1
- 2009年
- 目的分析中国汉族HIV-1感染者外周血白细胞线粒体DNA的非编码区的高变1区（HR1）突变情况，探讨HIV对线粒体影响。方法分离47例未接受过抗反转录病毒治疗、无机会性感染的HIV／AIDS患者的外周血细胞，提取外周血白细胞DNA，PCR扩增DNA非编码区HR1的大约600bp的DNA片段，产物纯化后进行测序，测序结果和剑桥序列比对，分析突变位点以及各位点的突变频率。结果HIV／AIDS患者在非编码HR1区（核苷酸位点16024-16383之间）有124个位点存在多态性，碱基变化率为0-20.47％（中位数为5.33％）。大多数突变方式是C→T或T→C的变化。在第16223核苷酸位点，共出现了36个C→T改变，发生率为70.97％（36／47）；在第16362核苷酸位点，共出现了26个T→C变化，发生率为55.32％（26／47），3个T→C改变，发生率为6.38％（3／47）；与以往报道数据类似。结论HIV-1可能导致线粒体非编码区突变增加。
- 吴亚松陈德喜陈新月石英柳雅立张洪海吴昊
- 关键词：HIV线粒体
- 时间分辨荧光免疫分析法检测C反应蛋白方法的建立及应用被引量：1
- 2010年
- 目的 制备4,7-（氯磺酸基苯基）-1,10-菲啰啉-2,9-二羧酸（BCPDA）鳌合剂,并以其建立时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术检测C反应蛋白（CRP）的方法.方法 用二甲基甲酰胺（DMF）溶解自制BCPDA后测定其吸光度;以BCPDA分别标记铕（Eu3＋）、CRP多克隆抗体制备CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3＋荧光标记物;以纳米磁珠为固相载体包被CRP单克隆抗体,分别加入CRP抗原及CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3＋,应用六合一板式检测仪检测CRP荧光强度.结果 自制BCPDA吸收光谱为220～360 nm, 用337 nm 的紫外光激发得到CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3＋的荧光发射光谱, 利用TRFIA可检测到0.1 mg/L 的CRP抗原.结论 本研究成功制备CRP多克隆抗体-BCPDA-Eu3＋荧光标记物并建立了TRFIA检测CRP的方法,此为临床检测CRP提供了新的思路,亦为TRFIA的推广应用提供了理论依据.
- 张欣刘煜垚薛运周马雪梅闫红钟儒刚
- 关键词：时间分辨荧光免疫分析法铕C反应蛋白
- 经国产齐多夫定、去羟肌苷、奈韦拉平联合抗病毒治疗3个月的艾滋病患者人类免疫缺陷病毒毒株的耐药突变被引量：4
- 2007年
- 目的研究我国AIDS患者经国产齐多夫定(AZT)、去羟肌苷(ddI)、奈韦拉平(NVP)联合抗病毒治疗3个月时血浆HIV毒株的耐药突变情况。方法收集124例经国产AZT、ddI、NVP联合抗病毒治疗3个月的AIDS患者的抗凝静脉血,流式细胞仪检测CD4^+ T淋巴细胞计数,RT-PCR扩增HIV pol区蛋白酶基因和部分逆转录酶基因片段,并测序,登录网站分析耐药突变。结果26例(21%)患者出现非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)耐药突变。共检测到10个位点发生NNRTI耐药突变:K101E/R、K103N/R、V106A/I、V1 79D、Y181C、Y1 88N、G190A/S、P225A、K238E和Y318F/S。发生率最高的突变位点是K1 03N.为8.1%。11例(8.9%)对台拉韦定(DLV)、依非韦伦(EFV)、NVP均高度耐药;19例(15.3%)对NVP高度耐药;15例(12.1%)对EFV高度耐药;11例(8.9%)对DLV高度耐药。5例(4%)患者出现核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)耐药突变,共检测到L210E、T21 5F/Y和K219Q/T三个位点,发生率分别为0.8%、1.6%和1.6%。3例(2.4%)分别出现G73C、184K、147L蛋白酶主要突变。48例(38.7%)出现蛋白酶次要突变:L63P/S/T/A为38.7%,V77I为36.3%,193L为33.0%,A71V/T/G为8.9%.K20*/Q/R为6.5%,D60E为0.8%。耐药组的CD4^+T淋巴细胞计数低于非耐药组.差异有统计学意义(P<0.05)。结论在抗病毒治疗过程中及时检测基因型耐药对尽早发现耐药变异、避免交叉耐药流行和选择恰当的治疗策略有重要意义。在无蛋白酶抑制剂选择压力下,HIV蛋白酶的主要突变及大量次要突变提示,在抗病毒治疗前行基因型耐药检测有重要意义。
- 李海英李韩平李敬云吴昊
- HIV假病毒用于p24抗原检测试剂研制的研究被引量：1
- 2010年
- 为了解决在研制新型HIV检测试剂盒时遇到的p24蛋白阳性对照物保存不便、阳性对照物稳定性不高以及蛋白结构和聚集形式与天然HIV病毒的p24存在差异等问题,通过将改造的HIV-1骨架质粒pNL43 EGFP R-E-和包膜蛋白质粒pGX-C共转染293T细胞后分离细胞培养液,获得具有单轮感染活性的HIV-1假病毒。通过对此假病毒颗粒的天然衣壳蛋白p24和市售HIV检测试剂盒中的p24蛋白阳性对照物的阳性反应有效性和保存稳定性的检测,证明了HIV-1假病毒p24蛋白具有更易保存、更稳定、更接近天然病毒p24蛋白的优点,适宜作为HIV检测试剂盒阳性对照物。
- 赵赫龙赵鹏翔李政马雪梅钟儒刚曾毅
- 关键词：假病毒HIV-1P24ELISA
- TAT-EGFP融合蛋白的表达及其在小鼠体内跨膜转导与分布的研究被引量：3
- 2008年
- 目的:建立TAT-EGFP融合蛋白在原核细胞中表达的试验方法,探讨该融合蛋白经过胎盘屏障后在小鼠体内跨越各种生物膜转导及分布情况。方法:将重组表达载体pET32-TAT-EGFP转化E.ColiBL21,得到稳定表达的融合蛋白,纯化后注入孕鼠腹腔内,注射后第3天分别取母鼠和仔鼠组织,并做快速冷冻切片,观察融合蛋白在小鼠体内的分布。结果:成功表达了相对分子质量为32×103的TAT-EGFP融合蛋白。该融合蛋白能在小鼠不同组织细胞内分布,在小肠上皮分布最为明显,并能透过胎盘及血脑屏障。结论:TAT介导的EGFP可在小鼠体内广泛跨膜转导分布,为进一步研究其他大分子活性物质进入细胞及其功能奠定了良好基础。
- 柳雅立陈德喜于志勇张洪海吴亚松石英吴昊
- 关键词：基因产物TAT重组融合蛋白质类蛋白质转运
