国家自然科学基金(81202440)
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
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- 相关机构：上海交通大学上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司沈阳药科大学更多>>
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 在东方拟无枝酸菌中建立I-SceI内切酶介导的无标记敲除系统
- 2015年
- 目的在东方拟无枝酸菌中建立由I-Sce I介导的无标记高效重组系统。方法首先构建可用于东方拟无枝酸菌的I-Sce I操作盒,通过敲除多烯类化合物ECO-0501合成相关基因hem A2,比较操作盒使用前后获得hem A2基因双交换突变株的效率。结果在没有引入I-Sce I的情况下,随机重组的发生几率仅约2%,而导入后,由于I-Sce I酶对引入DNA位点的双链切割,导致双交换重组的发生率提高至90%以上。结论 I-Sce I系统是一种可用于东方拟无枝酸菌无标记遗传操作的有效工具。
- 朱丽饶敏罗敏玉
- 希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)二十碳五烯酸生物合成基因簇的钓取及鉴定
- 2017年
- 希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)是从海洋动物肠道分离得到的1株产二十碳五烯酸(Ecicosapentaenoic acid,EPA)的海洋细菌。利用PCR方法、Overlap PCR及Gibson Assemble技术克隆该菌中包含pfaA、pfaB、pfaC和pfaD的EPA生物合成基因簇,全长18.4 kb。序列分析表明所钓取的合成基因簇与来自希瓦氏菌SCRC-2738的EPA合成基因簇有88%的相似度,均编码聚酮合酶。以构建的低拷贝表达载体pACYC-Trc为骨架,通过Gibson Assemble技术构建EPA基因簇表达质粒pLYSCY03。钓取大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)细胞中的entD基因,克隆至表达载体pTrc99a中,构建成为重组质粒pLYSCY01。将两个表达质粒同时导入大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中,获得产EPA的工程菌株。结果表明,希瓦氏菌中含有EPA聚酮生物合成基因簇,大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中的entD基因可以替代pfaE基因与钓取的EPA合成基因协同合成EPA。
- 盛超亚朱丽戈梅倪孟祥
- 关键词：二十碳五烯酸生物合成基因簇异源表达
- 东方拟无枝酸菌HCCB10007内attB位点的人工构建被引量：4
- 2014年
- 目的在万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌HCCB10007内构建attB整合位点,将噬菌体ΦC31重组酶介导的位点特异性整合系统引入该菌,从而提高该工业菌株的遗传操作效率。方法在不破坏结构基因的情况下经同源重组将来源于变铅青链霉菌的attB编码序列插入到东方拟无枝酸菌HCCB10007基因组中,然后将带有绿色荧光蛋白基因(eGFP)的特异性位点重组质粒pLYGYQ2导入该工程菌中。用于验证整合系统的有效性。结果获得基因组中整合有attB位点的基因工程菌LYGYQA。eGFP基因顺利整合入所构建的attB位点,并且获得了表达。同时发现该系统的整合效率较同源重组效率提高了约3倍。结论本研究不但表明来源于链霉菌的位点特异性整合系统可以成功应用于东方拟无枝酸菌中,也证明绿色荧光蛋白基因可以作为报告基因用于该菌的研究。
- 盖忆青朱丽陈代杰张怡轩
- 关键词：EGFP
- 东方拟无枝酸菌中基因AORI_2943的敲除对ECO-0501合成的影响
- 2015年
- 目的对位于ECO-0501生物合成基因簇内AORI_2943基因进行功能鉴定,进一步解析东方拟无枝酸菌中ECO-0501的生物合成途径。方法通过同源重组和定点整合的方式构建AORI_2943缺失、回补及过表达突变株。高效液相及质谱分析突变株发酵产物的变化,分析AORI_2943在ECO-0501合成中的作用。结果 AORI_2943缺失突变株不产ECO-0501和去甲基ECO-0501,只产生结构上缺失了C5N单位(2-氨基-3-羟基环戊-2-烯酮)的前体物质a和b,发酵液中未检测出C5N单位。对缺失突变株回补后,有少量ECO-0501及去甲基ECO-0501产生,同时仍然有大量前体化合物a和b的积累。在野生菌的基础上过表达AORI_2943,并未明显提高ECO-0501的产量。结论 AORI_2943是ECO-0501合成的关键基因,主要参与了ECO-0501前体化合物C5N单位的合成。
- 朱丽饶敏蒋美珍戈梅
