湖南省自然科学基金(06JJ2093)
- 作品数：15 被引量：42H指数：4
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- 幽门螺杆菌VacA N端真核表达载体的构建、鉴定及其诱导巨噬细胞空泡化和凋亡的观察被引量：2
- 2008年
- 目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)空泡毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)基因的真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/vacA,并在THP-1巨噬细胞中表达,为研究VacA单一毒力决定簇的致病性奠定实验基础。方法用Primer 5.0软件设计引物,以HP基因组为模板,PCR扩增vacA目的基因片段,克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR鉴定及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,荧光显微镜和Western-blot检测VacA蛋白在细胞中的表达;电镜观察巨噬细胞(MΦ)的空泡样变和凋亡;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果PCR扩增得到了大小约为1 428bp的目的片段,双酶切及测序鉴定证明成功构建了HP真核表达重组载体;转染后24h,重组质粒组部分细胞中有聚集的荧光颗粒,部分细胞发生空泡样变和凋亡改变;细胞凋亡率明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.001),细胞核因子-κB(nuclear factorkappaB,NF-κB)的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制细胞的凋亡。结论VacA蛋白瞬时高表达促进THP-1巨噬细胞空泡样变和凋亡。NF-κB可能参与调节VacA诱导的巨噬细胞凋亡。
- 黎村艳张艳刘志杰余敏君于文
- 关键词：幽门螺杆菌空泡毒素巨噬细胞凋亡
- 幽门螺杆菌Lpp20重组蛋白的表达、纯化及其免疫活性初步研究被引量：1
- 2010年
- 目的表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)脂蛋白Lpp20基因的重组蛋白,并检测其免疫活性。方法应用PCR技术从H.pylori标准株26695染色体DNA中扩增出Lpp20的编码基因片段,将其克隆至表达载体pGEX-6P-2上,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21中表达并进行GST亲和层析纯化,用Western blot方法检测纯化产物重组Lpp20(recombinantLpp20,rLpp20)的免疫反应性。免疫C57BL/6小鼠后,以rLpp20为包被抗原建立间接ELISA法对免疫小鼠血清进行特异性抗体检测;ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL-2、IL-4水平;MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞增殖反应等指标以分析rLpp20的免疫活性。结果扩增的lpp20全长528 bp,与GenBank上公布的H.pylori 26695株lpp20序列作BLAST比较,结果完全一致;成功构建了pGEX-6P-2/Lpp20重组质粒,表达的rLpp20 M_r 43 000,纯化产物可被鼠抗H.pylori抗体识别;以rLpp20为包被抗原建立的间接ELISA法检测免疫小鼠血清,与对照组相比rLpp20免疫组可见阳性反应;rLpp20免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL-2和IL-4含量均明显升高;脾淋巴细胞增殖反应测定,rLpp20免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数也明显升高,与对照组有明显差异。结论rLpp20具有良好的免疫活性,在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答,为筛选高效的H.pylori疫苗抗原奠定了基础。
- 靖吉芳张艳刘志杰于文
- 关键词：幽门螺杆菌LPP20重组蛋白蛋白表达免疫活性
- 幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI的研究进展
- 2008年
- 幽门螺杆菌（Hp）是世界各地最常见的感染性病原之一，能够在胃酸条件下生长和繁殖，是胃炎、消化道溃疡的重要致病因素，与胃癌的发生密切相关。最近研究表明，Hp酸适应性机制在于细菌内膜上存在尿素通道蛋白（UreI）。国内外对该蛋白的作用和酸适应性机制作了深入研究，结果表明UreI与Hp酸适应性密切相关。此文对尿素酶的基因结构、通道蛋白UreI的作用及其作用机制等进行了综述。
- 于文张艳
- 关键词：幽门螺杆菌消化道溃疡
- 幽门螺杆菌ureI和lpp20乳酸乳球菌表达载体的构建及鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的以幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI和外膜脂蛋白lpp20为目的基因,分别构建乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20,为H.pylori乳酸乳球菌活菌口服疫苗的研制奠定实验基础。方法根据幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI和脂蛋白Lpp20的全基因序列,利用PRIMER5.0各设计一对引物,进行PCR扩增,获得ureI和lpp20目的基因片段,将其与分泌表达载体pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,通过酶切分析,PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体,并进行重组疫苗菌稳定性检测。结果以H.pylori标准株基因组DNA为模板分别扩增出特异的ureI和lpp20基因片段,大小分别为588 bp和528 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori乳酸乳球菌表达重组载体pNZ8112/ureI和pNZ8112/lpp20。结论PCR扩增得到了大小约为588 bp和528 bp的H.pylori ureI和lpp20目的基因片段;并成功构建了幽门螺杆菌ureI及lpp20基因乳酸乳球菌表达重组载体。
- 于文靖吉芳张艳
- 关键词：幽门螺杆菌乳酸乳球菌口服疫苗
- 幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20的表达纯化及其临床应用的初步研究
- 2013年
- 目的获得重组幽门螺杆菌(H.pylori)脂蛋白(rLpp20),并研究其在血清学诊断中的应用价值。方法应用重组质粒pGEX-6P-2/Lpp20在大肠杆菌(E.coli)BL21中表达,并进行GST亲和层析纯化,用Western-blot检测纯化产物(rLpp20)的免疫反应性;以rLpp20为包被抗原建立ELISA法对200份患者血清标本进行特异性IgG抗体检测,并与幽门螺杆菌-IgG抗体检测试剂盒法进行比较。结果成功表达的rLpp20(43000Mr),纯化产物可被幽门螺杆菌多克隆抗体及阳性血清识别;成功建立了以rLpp20为包被抗原的间接ELISA法,其灵敏度为91.0%,特异度为100%。与试剂盒法比较,两者的符合率为95.5%。结论 Lpp20具有良好的免疫反应性,能与幽门螺杆菌阳性血清特异性结合,有望应用于幽门螺杆菌血清学诊断。
- 靖吉芳张艳
- 关键词：幽门螺杆菌重组蛋白LPP20血清学诊断
- 幽门螺杆菌空泡毒素诱导细胞凋亡相关研究进展
- 2009年
- 幽门螺杆菌是公认的胃相关疾病的病原菌,而空泡毒素(VacA)是其主要的致病因子,它除了可以引起细胞空泡样病变外,现已被广泛认为是一种凋亡诱导因子,它能通过线粒体、MAPK、NO等信号转导通路介导细胞凋亡,在诱导细胞凋亡的同时又与机体的免疫系统相互作用。从细胞动力学角度探讨VacA和细胞凋亡的关系已成为研究的热点,本文总结了VacA诱导细胞凋亡机制的最新研究进展,对研究VacA损伤胃黏膜机制以及相关疫苗的研制具有重要意义。
- 杨卓张艳
- 关键词：幽门螺杆菌VACA细胞凋亡
- 幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达被引量：1
- 2010年
- 目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。
- 李杰于文张艳靖吉芳
- 关键词：幽门螺杆菌
- 壳聚糖在黏膜免疫中的应用被引量：3
- 2009年
- 目的黏膜免疫可以诱导有效的黏膜和系统免疫反应，从而保护黏膜表面，是防止病原体在黏膜表面克隆并入侵的关键。但黏膜接种疫苗吸收效率低，黏膜免疫效果往往不理想，因此需要添加有效的黏膜免疫佐剂和载体系统来提高疫苗的效果。壳聚糖是一种被广泛应用的天然聚合物，无毒，具有生物粘附性和免疫调节作用，在黏膜免疫中作为佐剂和载体得到大量应用。
- 曹斌张艳
- 关键词：壳聚糖黏膜免疫核酸疫苗
- 幽门螺杆菌Lpp20-IL2核酸疫苗免疫活性被引量：6
- 2010年
- 【目的】观察pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫C57BL/6小鼠后所产生的体液免疫和细胞免疫应答水平,为研制高效、新型的幽门螺杆菌核酸疫苗提供实验依据。【方法】构建pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2重组载体,并转染HeLa细胞,用Western-blot观察鉴定其在真核细胞得到表达后免疫C57BL/6小鼠,ELISA间接法测定小鼠血清中抗Lpp20IgG抗体水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ、IL4水平,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,免疫荧光组化法检测Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中的表达情况。【结果】成功构建了pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2真核表达载体,且重组质粒能在HeLa细胞内有效表达目的蛋白;小鼠接种pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体,8w后ELISA测定血清抗体A450值明显升高。核酸疫苗pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,培养上清中IFN-γ、IL4含量明显升高。pcDNA3.1(+)/Lpp20-IL2和pcDNA3.1(+)/Lpp20核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后,刺激指数明显高于空质粒组和PBS组。Lpp20蛋白在小鼠肌肉组织中能够有效表达。【结论】幽门螺杆菌Lpp20-IL2融合基因核酸疫苗和Lpp20单基因核酸疫苗均能刺激机体产生较强细胞免疫应答和体液免疫应答,且前者能诱导更强的细胞免疫应答。
- 于文张艳靖吉芳刘志杰
- 关键词：幽门螺杆菌白细胞介素2核酸疫苗免疫活性
- 幽门螺杆菌Lpp20核酸疫苗的构建及其免疫活性的初步研究被引量：3
- 2008年
- 目的构建幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／Lpp20，并在HeLa细胞中进行表达。通过肌肉注射免疫C57BL／6小鼠，观察其诱导小鼠产生的体液免疫和细胞免疫应答水平。方法用PCR法扩增Lpp20全基因，再将Lpp20基因克隆至pcDNA3．1（＋）真核细胞表达载体构建pcDNA3．1（＋）／Lpp20重组体，观察其在HeLa细胞中的表达。将核酸疫苗pcDNA3．1（＋）／Lpp20、对照空质粒pcDNA3．1（＋）及PBS分组通过肌肉注射免疫6周龄C57BL／6小鼠，隔2周免疫一次，共免疫4次。间接ELISA法测定小鼠血清中抗Lpp20IgG抗体水平，双抗体夹心ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中IFN-1水平，MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应。通过PCR法检测小鼠肌细胞中Lpp20基因的存在。结果小鼠接种pcDNA3．1（＋）／Lpp20核酸疫苗后能产生特异性IgG抗体，6周后ELISA测定血清抗体A450值为0．74，效价为1：1024。核酸疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后，培养上清中IFN-γ含量明显升高[（410．36±56．23）pg／m1]，与空质粒组[（25．26±10．85）pg／m1]之间差异有统计学意义（P〈0．01）。脾淋巴细胞增殖反应测定，核酸疫苗组小鼠脾淋巴细胞经特异性抗原刺激后，刺激指数（2．37±0．22）明显高于空质粒组（1．53±0．47）和PBS组（1．20±0．13），P〈0．01。PCR检测Lpp20基因可在小鼠肌细胞中存在。结论成功构建了pcDNA3．1（＋）／Lpp20核酸疫苗，且其在小鼠体内可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫应答。为进一步研究该疫苗的免疫保护作用提供实验依据。
- 刘志杰张艳黎村艳邱宏余敏君
- 关键词：幽门螺杆菌LPP20DNA疫苗免疫反应性
