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酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因单倍体缺陷型突变株的构建被引量：3: 2014年; 羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)编码的羊毛甾醇合酶是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甾醇生物合成途径中重要的限速酶。酿酒酵母固有的甲羟戊酸(MVA)/麦角甾醇代谢途径的中间体2,3-氧化鲨烯也是三萜类化合物的合成前体。因此,羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点。下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢,可为应用合成生物学技术在酿酒酵母中组建三萜类化合物的代谢途径奠定基础。本研究通过设计含有与erg7基因ORF序列两侧同源的长引物,以质粒PUG66为模板进行PCR,构建带有loxP-Marker-loxP的erg7基因敲除组件,采用LiAc/SS Carrier DNA/PEG方法转化双倍体野生型酿酒酵母INVSc1,通过同源重组的方式构建酿酒酵母erg7基因单倍体缺陷型突变株。半定量PCR和实时定量PCR结果表明,突变株内erg7基因表达水平下降约1倍。TLC和HPLC结果表明,突变株内麦角甾醇含量下降至野生型菌株的42%。; 高丽丽王庆华梁会超巩婷杨金玲朱平; 关键词：酿酒酵母同源重组麦角甾醇

人参达玛烯二醇-Ⅱ合酶在酿酒酵母中的表达、定位及功能研究被引量：4: 2016年; 为了研究人参达玛烯二醇-Ⅱ合酶(dammarenediol-Ⅱ synthase,DS)在酿酒酵母中的重组表达和定位,本研究克隆了人参中达玛烯二醇-Ⅱ合酶基因ds,并将其与绿色荧光蛋白基因gfp融合,构建了相应的重组表达质粒pESC-HIS-DS和pESC-HIS-DS-GFP,转化酿酒酵母INVSc1,获得了重组菌INVSc1-DS和INVSc1-DS-GFP。通过差速离心法制备重组菌微粒体,荧光显微镜下观察达玛烯二醇-Ⅱ合酶的表达及亚细胞定位,并通过酶促反应对该酶进行了功能鉴定,结果表明,DS为膜结合型蛋白,在体外能催化2,3-氧化鲨烯生成达玛烯二醇-Ⅱ。对重组菌发酵产物进行分析,结果表明,重组菌中产生了达玛烯二醇-Ⅱ,且通过将ds与gfp融合,重组菌中的达玛烯二醇-Ⅱ产量由7.53 mg·g^(-1)提高到12.24 mg·g^(-1),该结果为优化在酿酒酵母中构建的人参皂苷代谢途径提供了新思路。; 梁会超高丽丽胡宗风巩婷陈晶晶杨金玲朱平; 关键词：绿色荧光蛋白酿酒酵母

人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究基本策略及进展被引量：10: 2015年; 人参、西洋参和三七等传统中药材因其广泛且良好的药理活性一直倍受关注,而人参皂苷是其主要活性成分。糖基转移酶是催化人参皂苷生物合成最后一步的关键酶。人参皂苷苷元经过糖基转移酶的修饰,产生了复杂多样的人参皂苷,从而具有广泛的药理活性。目前人们已通过合成生物学技术实现了人参皂苷苷元和稀有人参皂苷compound K的合成。人参皂苷苷元的糖基化作为人参皂苷生物合成途径的最后一步,是整个合成途径中最重要的环节之一,近年来也取得了一些研究进展。本文介绍了人参皂苷生物合成途径中相关糖基转移酶研究的基本策略,并对相关进展进行了综述,为人参皂苷生物合成途径的深入解析及通过合成生物学途径获得人参皂苷提供理论参考。; 梁会超王庆华巩婷杜国华杨金玲朱平; 关键词：人参人参皂苷生物合成糖基转移酶合成生物学

利用反义RNA技术抑制酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因的表达被引量：9: 2015年; 羊毛甾醇合酶催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点,下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢途径可促进其流向三萜类化合物的代谢途径。有鉴于此,本研究根据酿酒酵母羊毛甾醇合酶基因(lanosterol synthase gene,erg7)序列设计引物,扩增5'长片段(包括erg7基因5'非编码区启动子序列和部分编码区序列)、5'短片段(包括erg7基因5'非编码区部分启动子序列和部分编码区序列)和erg7基因编码区片段,分别将其反向克隆到表达载体p ESC-URA上,构建反义表达质粒。用反义表达质粒转化酿酒酵母INVSc1,在营养缺陷型培养基SD-URA上筛选重组菌株。通过半定量PCR进行检测,结果表明:与INVSc1相比,转入erg7基因编码区反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量没有显著变化,而转入5'长反义片段和5'短反义片段的重组菌株内羊毛甾醇合酶基因表达量明显降低。通过TLC和HPLC方法比较麦角甾醇含量,结果表明:与INVSc1相比,转入5'短反义片段和erg7基因编码区反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量没有显著变化,而转入5'长反义片段的重组菌株内麦角甾醇含量明显降低。本研究利用反义RNA技术抑制酿酒酵母中羊毛甾醇合酶基因的表达,为应用合成生物学技术在酿酒酵母中组建三萜类化合物代谢途径奠定了基础。; 王庆华高丽丽梁会超杜国华巩婷杨金玲朱平; 关键词：酿酒酵母反义RNA 麦角甾醇

采用基因敲除和反义技术抑制酿酒酵母ERG7基因表达被引量：2: 2013年; 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)固有的甲羟戊酸(MVA)/麦角甾醇代谢途径生成的中间体2,3-氧化鲨烯是三萜类化合物的合成前体,以酿酒酵母为底盘细胞通过合成生物学技术组建这些化合物的代谢途径时,需要下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢流。在酿酒酵母中由羊毛甾醇合酶(ERG7)催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点。采用基因敲除和反义RNA 2种技术对ERG7基因的表达进行下调。设计含有与ERG7基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒PUG66为模板进行PCR扩增,构建带有loxP-Marker-loxP的ERG7基因敲除组件,采用LiAc/SS Carrier DNA/PEG方法转化双倍体酿酒酵母INVSc1,通过同源重组的方式获得酿酒酵母ERG7基因单倍体缺失突变株,并对其进行了分子生物学确证。大量培养野生型和突变型菌株,菌体冷干后在碱醇溶液中90℃回流1h,正己烷萃取后旋蒸干溶剂,甲醇溶解残留物麦角甾醇。通过TLC和HPLC方法比较麦角甾醇含量,结果表明:与野生型菌株相比,突变型菌株的麦角甾醇含量明显降低。; 高丽丽杨金玲朱平; 关键词：酿酒酵母基因敲除反义RNA

在酿酒酵母中组建人参皂苷苷元代谢途径的研究: 目的通过合成生物学技术探索生产人参皂苷苷元的新途径。方法以酿酒酵母固有的甲羟戊酸(MVA)途径合成2,3-氧化鲨烯为上游功能模块;以人参细胞为材料,通过RT-PCR获得达玛烯二醇-II合酶和相关细胞色素P450等人参皂苷...; 杨金玲高丽丽王庆华梁会超巩婷朱平; 关键词：细胞色素P450酶酿酒酵母合成生物学; 文献传递

过表达HMGR催化结构域以优化酵母工程菌原人参二醇代谢途径的研究被引量：3: 2016年; 目的过表达3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)催化结构域提高酵母工程菌中原人参二醇的产量。方法分别克隆酿酒酵母中编码3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶催化结构域的基因t HMG1、人参中达玛烯二醇-Ⅱ合酶基因ds和原人参二醇合酶基因cyp1、拟南芥中CYP450还原酶基因cyp-re,构建相应表达质粒,转化酿酒酵母INVSc1,并检测重组菌中原人参二醇产量。结果重组菌INVSc1-DS-GFP/CYP1/CYP-Re和INVSc1-DS-GFP/CYP1/CYP-Re/t HMG1中原人参二醇产量分别为3.04 mg·L-1和26.5 mg·L-1。结论导入基因t HMG1,使原人参二醇产量提高了8.7倍,该结果为优化酵母工程菌中人参皂苷代谢途径奠定了基础。; 梁会超胡宗风梁兰巩婷陈晶晶杨金玲朱平; 关键词：原人参二醇酿酒酵母代谢途径

毕赤酵母Muts与Mut＋重组子表达蝎毒镇痛活性肽BmK AngM1水平比较被引量：1: 2015年; 蝎毒镇痛活性肽Bm K Ang M1是从东亚钳蝎(Buthus martensii Karsch)蝎毒中分离得到的一种新型长链蝎毒素,其镇痛活性强且毒性低,有望开发成镇痛新药。本文将Bm K Ang M1基因转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,筛选得到甲醇利用缓慢型(Muts)和快速型(Mut+)的重组子;采用实时荧光定量PCR方法,检测了Mut+重组子中Bm K Ang M1基因的拷贝数,筛选出含单拷贝Bm K Ang M1基因的Mut+重组子;在相同培养条件下,比较了含单拷贝Bm K Ang M1基因的Muts和Mut+重组子表达Bm K Ang M1的水平。结果表明,Muts重组子中Bm K Ang M1基因转录水平是Mut+重组子的2.7倍,Muts重组子中Bm K Ang M1蛋白表达量是Mut+重组子的1.5倍。因此,Muts重组子比Mut+重组子具有更强的Bm K Ang M1表达能力。; 王庆华梁兰陈晶晶巩婷侯琦杨金玲朱平; 关键词：毕赤酵母基因拷贝数

人参糖基转移酶PgUGT74AE2催化生成新型人参三醇皂苷研究被引量：5: 2018年; 人参(Panaxginseng)来源的糖基转移酶Pg UGT74AE2能够催化原人参二醇(protopanaxadiol,PPD)的C-3位羟基发生糖基化反应,生成人参皂苷Rh2,但其催化原人参三醇(protopanaxatriol,PPT)的C-3位羟基发生糖基化反应的研究至今未见报道。本研究构建重组表达质粒p ET-32a-Pg UGT74AE2,转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,获得重组菌株Transetta-Pg UGT74AE2。通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside, IPTG)诱导表达,获得重组Pg UGT74AE2。建立重组Pg UGT74AE2催化PPT的酶促反应体系,结果表明,Pg UGT74AE2能够催化PPT的C-3位羟基发生糖基化反应,生成产物3-O-β-D-glucopyranosyl-dammar-24-ene-3β,6α,12β,20S-tetraol。本研究通过酶促反应获得C-3位糖基化的新型人参三醇皂苷,可为创新药物研究提供原料。; 张婷婷梁会超巩婷胡宗风顾安頔杨金玲朱平; 关键词：人参糖基转移酶糖基化

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北京市自然科学基金(7122115)

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