国家自然科学基金(30470782)
- 作品数：13 被引量：32H指数：4
- 相关作者：于红刚曹俊于皆平罗和生宋文冲更多>>
- 相关机构：武汉大学中国科学院南京大学医学院附属鼓楼医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 黏着斑激酶在结肠癌组织中的表达及意义
- 2009年
- 目的探讨黏着斑激酶(FAK)在结肠癌发生、发展中的作用。方法采用RT-PCR法检测30例新鲜结肠癌及与之相对应的癌旁组织的FAKmRNA表达;同时用Western印迹法检测20例新鲜结肠癌及相对应的癌旁组织FAK蛋白表达水平,调平每对组织FAK蛋白含量后再行FAKTyr397磷酸化位点蛋白检测。结果30例结肠癌组织FAKmRNA阳性率为90.0%,其表达值为0.745±0.530,对应癌旁组织阳性率为43.3%,其表达值为0.241±0.131(P<0.01);20例结肠癌组织FAK蛋白阳性率为95.0%,表达值为0.482±0.150;对应癌旁组织阳性率为60.0%,表达值为0.269±0.015;P均<0.01。20例结肠癌组织中FAKTyr397磷酸化蛋白阳性率为90.0%(18/20),表达值为0.385±0.021;而对应癌旁组织阳性率为20%(4/20),表达值为0.110±0.005,P均<0.01。结论FAK特别是FAKTyr397磷酸化蛋白表达增加在结肠癌的发生、发展中可能起重要作用。
- 刘启胜董卫国于红刚
- 关键词：黏着斑激酶磷酸化
- 胃泌素干预影响人结肠癌细胞P190RhoGAP磷酸化的机制被引量：6
- 2007年
- 目的:研究胃泌素对人结肠癌细胞P190RhoGAP的酪氨酸磷酸化水平的影响。方法:使用胆囊收缩素2受体(CCK2R)的真核表达载体pCR3.1/CCK2R转染人结肠癌细胞株Colo320,上调胃泌素表达;使用胃泌素拮抗剂下调胃泌素表达。使用相同浓度的胃泌素(1×10-7mol/L)按时间梯度刺激细胞;采用蛋白质印迹法检测总FAK、酪氨酸磷酸化的FAK的表达情况,并确定FAK最大磷酸化时间点;以免疫沉淀和蛋白质印迹法检测FAK最大磷酸化时间点的P190RhoGAP的酪氨酸磷酸化水平。结果:胃泌素引起FAK最大酪氨酸磷酸化作用时间点为12 h,胃泌素刺激12 h较0 h、胃泌素拮抗剂+胃泌素刺激12 h后P190RhoGAP的酪氨酸磷酸化水平明显增加。结论:P190RhoGAP为FAK的下游信号分子,酪氨酸磷酸化的P190RhoGAP在胃泌素-CCK2R-FAK信号通路引起肿瘤细胞的侵袭、浸润、转移过程中发挥重要作用。
- 宋文冲于皆平曹俊刘军沈磊于红刚
- 关键词：胃泌素缩胆囊素结肠肿瘤黏着斑激酶
- 胃泌素对人结肠癌细胞NF-κB信号通路的影响被引量：2
- 2010年
- 目的探讨胃泌素对人结肠癌细胞Colo320WT中核转录因子NF-κB通路的影响。方法实验分为4组:对照组(C)、胃泌素组(G17)、胃泌素+L365,260组(G17+L365,260)及L365,260组。胃泌素组用胃泌素干预Colo320WT细胞12h,胃泌素加L365,260组是先用胃泌素受体拮抗剂L365,260预干预Colo320WT细胞30min,再用胃泌素干预12h,L365,260组是L365,260干预Colo320WT细胞30min。用EMSA测定NF-κB活性,用RT-PCR测定uPA的mRNA表达,免疫印迹方法测定uPA蛋白的表达。结果胃泌素干预Colo320WT细胞后NF-κB的活性明显增加,uPA蛋白和mRNA表达明显增加。L365,260阻断后,细胞NF-κB活性下降、uPA蛋白和mRNA表达降低。结论胃泌素可活化Colo320WT细胞中NF-κB的信号通路。
- 曹俊邹晓平于成功于红刚
- 关键词：胃泌素受体结肠癌尿激酶型纤溶酶原激活物
- 胃泌素促进人大肠癌细胞系Colo320WT侵袭力增加的分子机制探讨被引量：8
- 2007年
- 目的探讨胃泌素促进人大肠癌细胞侵袭力增加的分子机制。方法脂质体转染表达胃泌素受体(CCK-2R)的 pCR3.1/GR 质粒于结肠癌细胞 Colo320中,G418筛选出稳定表达 CCK-2R 的阳性克隆,逆转录 PCR 和免疫印迹鉴定,转染成功命名为 Colo320WT。应用1×10^(-8) mol/L 胃泌素以时间梯度0、1、6、12、24、48 h 干预 Colo320WT 细胞,同时应用胃泌素受体拮抗剂 L365,260干预 Colo320WT 细胞30 min,再加1×10^(-8) mol/L 胃泌素干预12 h。免疫印迹检测Colo320WT 细胞中的磷酸化黏着斑激酶(FAK)Tyr397和总 FAK 表达。共聚焦显微镜观察磷酸化FAKTyr397在板状伪足的定位表达。免疫共沉淀检测 FAK-Src-p130^(Cas)-Dock180信号复合物的形成。Pull-down 测定 Rac 活性。结果随着胃泌素干预时间的延长,磷酸化 FAKTyr397的表达量呈增加趋势,且12 h 达最大,但对总的 FAK 无明显影响,磷酸化的 FAKTyr397/FAK 比值分别为2.82%、9.28%、22.62%、38.59%、28.41%、14.94%。L365,260阻断后的磷酸化的 FAKTyr397/FAK 的比值为7.21%。定位在板状伪足上磷酸化的 FAKTyr397也呈增加趋势,12 h 达最大。免疫共沉淀检测发现 FAK、Src、p130^(Cas)和 Dock180在胃泌素的干预下形成了信号复合物。Pull-down 测定证明胃泌素能活化 Rac,但对总 Rac 表达无影响。胃泌素受体拮抗剂 L365,260阻断可胃泌素引起的效应。结论胃泌素能增加大肠癌细胞的侵袭力可能是通过其与受体作用后使 FAK 发生磷酸化,促进磷酸化FAKTyr397定位在板状伪足、使 FAK-Src-p130^(Cas)-Dock180信号复合物形成以及活化 Rac。
- 曹俊于皆平周岚宋文冲罗和生于红刚
- 关键词：结肠肿瘤肿瘤侵润伪足
- hFRNK基因对胃泌素诱导的人结肠癌细胞侵袭力的影响被引量：1
- 2008年
- 目的 观察腺病毒介导hFRNK基因对胃泌素所诱导的人结肠癌Col0320WT细胞侵袭力的影响。方法 试验分为胃泌素组、hFRNK组和对照组，胃泌素组用100μmol／L胃泌素诱导结肠癌Col0320WT细胞12h；hFRNK组，首先用脂质体瞬时转染腺病毒受体pCR3．1-CAR于Col0320WT细胞48h，然后用100μmol／L胃泌素干预结肠癌Col0320WT细胞12h，再用重组腺病毒（pAdhFRNK）感染细胞；对照组为未经处理的Col0320WT细胞。用免疫印迹检测hFRNK基因黏着斑激酶（FAK）397位酪氨酸（FAKTyr397）的磷酸化表达，激光共聚焦显微镜观察FAKTyr397在细胞板状伪足的表达情况，免疫共沉淀检测hFRNK基因对四联信号复合物FAK-Src-Dockl80-p130Cas形成的影响，Pull-down法检测hFRNK对Rac蛋白活性的影响。结果 胃泌素诱导后，磷酸化FAKTyr397明显增强；与胃泌素组相比，hFRNK组中FAKTyr397表达下降，FAKTyr397定位到细胞板状伪足的量明显减少，FAK、Src、Dockl80和p130Cas四联信号复合物没有形成，Rac的活性降低。结论 hFRNK基因可阻断胃泌素引起的FAK的磷酸化，阻断FAKTyr397摹积到细胞的板状伪足，阻止四联信号复合物FAK-Src-Dockl80-p130Cas的形成以及Rac的活化，为hFRNK基因防治肿瘤的侵袭和转移提供理论依据。
- 曹俊邹晓平诸葛宇征于成功于红刚
- 关键词：结肠癌肿瘤基因胃泌素
- 抑瘤细胞运动和侵袭的鼠FRNK重组腺病毒的构建
- 2006年
- 目的应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建小鼠FRNK基因重组腺病毒,并在293HEK细胞中扩增制备重组病毒。方法把小鼠FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pad- Track-CMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-FRNK,经Pme I内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到293HEK细胞进行包装,获得FRNK重组腺病毒pAdFRNK。荧光显微镜下观察绿荧光的表达。结果经酶切和绿荧光表达证明了小鼠FRNK基因的重组腺病毒载体pAdFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论成功构建携带小鼠FRNK基因的重组腺病毒pAdFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。
- 曹俊孙铁汉丁铭佑陈颖刘超红于皆平于红刚
- 关键词：腺病毒载体基因治疗
- 胃泌素对结肠癌细胞中粘着斑激酶通路下游E-钙粘蛋白/β-连环蛋白复合物的影响被引量：4
- 2006年
- 目的探讨胃泌素对结肠癌细胞CoLo320WT中粘着斑激酶(FAK)通路下游E-钙粘蛋白/β-连环蛋白(E-cadherin/β-catenin)复合物分布的影响；方法脂质体转染表达胃泌素受体CCK-2R的pCR3．1/GR质粒于结肠癌细胞CoLo320中,G418筛选出稳定表达CCK-2R的阳性克隆,RT-PCR鉴定,转染成功命为CoLo320WT。应用10^(-8)mmol/L胃泌素(G17)以时间梯度(0h、1h、6h、12h、24h、48h)干预CoLo320WT细胞,同时应用10^(-6)mmol/L胃泌素受体拮抗剂L365．260干预CoLo320WT细胞30 min,再予10^(-8)mmol/L胃泌素干预。采用免疫印迹法检测磷酸化的FAK Tyr397和总FAK的表达。采用免疫共沉淀和免疫印迹法检测CoLo320WT中TX-100溶解和未溶部分中的E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的表达。用免疫细胞化学法观察E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的在胞膜、胞质和胞核的分布。结果随着胃泌素干预时间的延长,细胞中磷酸化的FAK Tyr397的表达量呈增加趋势,12h达最大值。胃泌素受体拮抗剂L365,260阻断后磷酸化的FAK Tyr397表达减少。而胃泌素对总FAK没有明显影响。TX-100可溶性部分中E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的量在胃泌素干预后表达减少,拮抗剂L365,260阻断后又增加。而TX- 100不溶解部分中表达却相反。免疫细胞化学观察到在胃泌素干预下CoLo320WT细胞中E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的分布发生胞质和胞核转移。结论胃泌素与其受体CCK-2受体结合,磷酸化的FAK Tyr397、激活FAK通路进而影响结肠癌细胞中E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的分布,促进结肠癌细胞侵袭和转移。
- 曹俊于皆平周岚宋文冲罗和生于红刚
- 关键词：胃泌素大肠癌
- hFRNK基因转移对结肠癌细胞中E-钙黏素／β-连环素复合物的影响被引量：1
- 2007年
- 目的研究hFRNK基因对结肠癌细胞Colo320WT中E-钙黏素（E-cadherin）／β-连环素（β-catenin）复合物的影响。方法利用AdEasy^TM系统在大肠肝菌内同源重组构建表达人FRNK基因的腺病毒载体pAdhFRNK。脂质体转染pCR3．1／GR质粒于结肠癌细胞Colo320中,G418筛选出稳定表达CCK-2R的阳性克隆,RT-PCR鉴定。用10^-8 mol／L胃泌素干预Colo320WT细胞12 h和pAdhFRNK体外感染Colo320WT细胞2 d后,再用10^-8 mol／L的胃泌素干预细胞12 h,然后用免疫共沉淀观察TX-100可溶性部分和不溶性部分的E-cadherin和β-catenin的表达。利用细胞化学方法观察E-cadherin和β-catenin在Colo320WT细胞中的分布情况。结果在胃泌素干预12 h后的TX-100可溶性部分中,E-cadherin和β-catenin的表达量明显降低,而TX-100不溶解部分表达增加。pAdhFRNK感染胃泌素干预后的细胞,在TX-100可溶性部分中,E-cadherin和β-catenin的表达量增加,而TX-100不溶性部分中表达降低。细胞化学方法显示,E-cadherin和β-catenin在胃泌素干预12 h后,由胞膜向胞内和胞核转移,而胃泌素干预pAdhFRNK感染后的细胞中,两者分布又逆转。结论hFRNK基因可明显对抗外源性胃泌素引起Colo320WT细胞中E-cadherin和β-catenin的分布异常,其机制可能是通过阻断FAK磷酸化及其通路而实现。
- 曹俊于皆平刘超红陈新文刘嵩罗和生于红刚
- 关键词：腺病毒载体
- 胃泌素对人结肠癌细胞Colo320WT中β-catenin／Tcf-4通路的影响被引量：2
- 2008年
- 目的探讨胃泌素对结肠癌细胞Colo320WT中β-catenin/Tcf-4通路影响。方法10-8mol·L-1胃泌素分别于0、1、6、12、24、48h时间点干预Colo320WT细胞,同时先用10-6mol·L-1胃泌素受体拮抗剂L365,260预干预Co-lo320WT细胞30min,再加10-8mol·L-1胃泌素干预至12h。采用免疫共沉淀和免疫印迹检测Colo320WT中TX-100可溶性部分(胞质部分)和不可溶部分(细胞骨架结合部分)中β-catenin的表达及β-catenin/Tcf-4复合物的表达。免疫印迹观察c-Myc和cyclinD1的表达。结果TX-100可溶性部分中β-catenin的量随着胃泌素干预时间呈递减趋势,12h达最小;而TX-100不溶解部分却随时干预时间的呈递增趋势,12h达最大。免疫共沉淀发现胃泌素干预后β-catenin/Tcf-4复合物表达量明显增多。免疫印迹检测到胃泌素干预下的细胞中c-Myc和cyclinD1表达明显增加。胃泌素受体拮抗剂阻断后,则可阻断胃泌素引起的上述效应。结论胃泌素与其受体作用后使结肠癌细胞中β-catenin分布发生转移和活化β-catenin/Tcf-4通路来降低结肠癌细胞的黏附,增加肿瘤细胞的侵袭和转移。
- 曹俊邹晓平诸葛宇征于成功于红刚
- 关键词：胃泌素大肠癌
- 人FRNK重组腺病毒的构建被引量：1
- 2007年
- 目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。
- 曹俊于皆平刘超红刘启胜齐元玲于红刚
- 关键词：基因治疗腺病毒
