天津市卫生局科技基金(99KY047)
- 作品数：8 被引量：16H指数：3
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- 一种简易、廉价、高效构建重组腺病毒载体的方法被引量：9
- 2005年
- 目的:建立构建重组腺病毒载体的简易、廉价、高效方法,为进一步应用含自杀基因的重组腺病毒治疗恶性肿瘤奠定基础。方法:PmeⅠ线性化腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV、切胶纯化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1按一定比例混合后,以化学转化法导入大肠杆菌BJ5183,在菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP。以脂质体法将重组质粒转染293细胞包装重组腺病毒rAdGFP。结果:细菌内同源重组率高达80%;在293细胞中成功产生重组腺病毒。结论:对目前应用广泛的AdEasy系统进行了有效改进,在获得较高阳性重组率的同时,降低了对实验室设备的要求。
- 尹冰楠李冬田李秋香
- 关键词：腺病毒载体大肠杆菌同源重组
- 含HSV-TK基因的重组腺病毒的构建及其对肿瘤细胞的抑制作用
- 2004年
- 目的 :构建含HSV -TK基因的重组腺病毒AdTK并观察AdTK/GCV系统对体外培养的PG49、H460、MCF -7和HeLa4种肿瘤细胞株的抑制作用。方法 :采用同源重组法构建AdTK ;用MTT法测定细胞生长抑制率。结果 :已成功构建了AdTK ;AdTK/GCV系统对4种肿瘤细胞的生长抑制率随AdTK、GCV浓度及作用时间的增加而升高。结论
- 李秋香李冬田佟惠春
- 关键词：腺病毒细胞生长抑制率肿瘤细胞系基因治疗
- 腺病毒载体及其应用被引量：1
- 1999年
- 李芳芳李冬田
- 关键词：腺病毒载体基因治疗
- 恶性肿瘤自杀基因治疗中GCV和ACV体外抑瘤作用的比较研究
- 2002年
- 目的 :用含有HSV -TK基因的重组腺病毒/丙氧鸟苷系统(AdTK/GCV)及该重组病毒/无环鸟苷系统(AdTK/ACV) ,在体外分别对4种肿瘤细胞进行抑瘤实验 ,比较GCV、ACV对肿瘤细胞的抑制效果。方法:将同滴度AdTK感染的4种肿瘤细胞分别加入GCV、ACV ,用MTT法测定OD值 ,计算细胞抑制率 ,用SPSS统计软件进行数据分析。结果:相同浓度的GCV与ACV相比 ,对肿瘤细胞的抑制率无显著差异。结论:由于ACV最大耐受量是GCV的4倍 ,且价格低廉 ,故在AdTK自杀基因治疗中可用ACV取代GCV。
- 佟惠春李冬田朱乃军
- 关键词：无环鸟苷丙氧鸟苷
- 重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用被引量：3
- 2008年
- 目的:探讨含腺病毒基因E1A、融合自杀基因CDglyTK及报告基因GFP的重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK与酶前体药物5-FC和(或)GCV联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用。方法:将重组腺病毒质粒prAd-E1A-CDglyTK经脂质体介导转染293细胞,进行病毒的扩增、纯化与PCR鉴定,以紫外分光光度法与TCID50法测定纯化病毒的颗粒浓度与感染性滴度,计算病毒比活性;在SKOV3细胞中观察重组病毒的复制能力及感染效率,确定感染率达90%以上的最小MOI。用MTT法观察感染重组病毒的SKOV3细胞对5-FC或GCV的敏感性,并计算IC_(50);观察一定MOI的rAd-E1A-CDglyTK或重组复制缺陷型腺病毒rAd-CDglyTK与IC_(50)的5-FC和(或)GCV联合应用对SKOV3细胞生长的抑制作用。结果:经PCR和琼脂糖凝胶电泳证实,纯化重组腺病毒中存在E1A和CDglyTK两个基因片段,其病毒颗粒浓度和感染性滴度分别为9.47×10^(11) VP/ml和3.16×10^(10)IU/ml,病毒比活性为3.34%。重组病毒可在SKOV3细胞中复制,对SKOV3细胞的感染效率随MOI的增加而增加,可致细胞感染率达90%以上的最小MOI为50 IU/cell。5-FC或GCV明显抑制感染细胞的生长,且存在明显的剂量依赖效应。两种重组腺病毒/前药系统的抑瘤作用比较显示,rAd-E1A-CDglyTK组细胞生长抑制率[(16.57±1.59)%]显著高于rAd-CDglyTK组[(10.44±1.80)%,P<0.01];与IC_(50)的5-FC和GCV双药联合应用,其抑制率达(71.68±2.63)%,显著高于rAd-CDglyTK/5-FC+GCV组的(63.64±2.91)%(P<0.01)。结论:重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK与酶前体药物联合应用对卵巢癌SKOV3细胞具有显著的抑制作用,其效果优于重组复制缺陷型腺病毒rAd-CDglyTK。
- 周丽君李秋香李冬田曹阳李光明佟惠春
- 关键词：卵巢癌重组腺病毒自杀基因SKOV3细胞
- HSV-TK基因重组腺病毒旁杀伤效应机制初探
- 2002年
- 目的 :探讨HSV -TK基因重组腺病毒 (AdTK)旁杀伤效应的机制。方法 :用MTT法计算细胞抑制率 ,数据采用单因素方差分析。结果 :病毒感染过的肿瘤细胞和经AdTK/GCV系统处理的肿瘤细胞培养上清液与未感染的肿瘤细胞按不同比例混合均显示出对肿瘤细胞的抑制作用。前者的抑制率随感染AdTK细胞比例的增加而增高 ,后者随上清液浓度的增加而升高。结论 :旁杀伤效应在TK自杀基因的治疗中起非常重要的作用。
- 李秋香李冬田朱乃军佟惠春
- 关键词：细胞抑制率自杀基因疗法HSV-TK基因重组腺病毒
- 含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒的构建与鉴定
- 2008年
- 目的:构建含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒,并在肺腺癌细胞A549中验证其复制能力和溶瘤特性。方法:建立重叠延伸PCR方法,用该方法制备的E1A-IRES片段插入AdEasy载体构建含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒rAdE1A-CDglyTK。并用该病毒与复制缺陷型重组腺病毒rAd-CDglyTK分别感染肿瘤细胞A549,从荧光蛋白表达、细胞病变及病毒增殖等方面进行比较,以确定其复制能力及溶瘤特性。结果:成功构建了含融合自杀基因CDglyTK的复制型重组腺病毒rAdE1A-CDglyTK,该病毒感染肿瘤细胞A549后报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达,能大量增殖并出现明显的细胞病变效应(CPE)。结论:构建的复制型重组腺病毒在肿瘤细胞内的复制能力、溶瘤特性和外源基因的表达明显优于目前广泛应用的复制缺陷型重组腺病毒。
- 曹阳李冬田魏殿军
- 关键词：基因腺病毒科基因自杀
- 高效化学转化菌内同源重组法构建重组腺病毒被引量：3
- 2005年
- 目的:对细菌内同源重组法构建重组腺病毒AdEasy系统加以改进,为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定基础。方法:将自杀基因CD和HSV-TK插入穿梭质粒pAdTrack-CMV中,PmeⅠ酶切后,用酚∶氯仿抽提、乙醇沉淀或切胶回收纯化;分别采用电穿孔转化法和化学转化法将线性穿梭质粒(pAdTrackCMV-CDglyTK)与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌内实现同源重组;将重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP-CDglyTK以脂质体介导至293细胞中进行包装、扩增。结果:采用切胶回收化学转化法获得阳性重组率最高(100%)。经PCR、酶切以及测序等方法鉴定,证实融合自杀基因已成功插入腺病毒中。结论:对细菌内同源重组法构建重组腺病毒的方法进行了改进,在降低实验成本的同时获得了较原法更高的阳性重组率,并成功构建了复制缺陷性重组腺病毒rAd-CDglyTK。
- 尹冰楠李冬田李秋香佟惠春李光明
- 关键词：重组腺病毒融合自杀基因293细胞肿瘤疗效PME
