国家科技重大专项(2009ZX08010-023B)
- 作品数：7 被引量：20H指数：3
- 相关作者：蒋泓邓廷贤刘连周天鸿严爱芬更多>>
- 相关机构：佛山科学技术学院暨南大学华南农业大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家自然科学基金广东省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：生物学农业科学医药卫生自动化与计算机技术更多>>
- 多基因编辑与多基因联合干预
- I.问题的提出:靶向药物治疗十分有效,但靶向药物的数量实在太少。既然针对靶点的靶向药物有效,那么针对靶点基因的干预治疗也将有效,多基因靶向干预也将更加有效。本研究旨在寻找高表达位点、安全靶位点,建立高效基因定点插入技术。...
- 唐冬生严爱芬刘连冯娟冯翠兰
- 关键词：TALENE-CADHERINBMI-1基因打靶
- 文献传递
- 人工锌指核酸酶的电子设计与结构模拟
- 2011年
- 以电子设计用于猪的多位点基因打靶的人工锌指核酸酶为例,探索如何电子设计优化理想的人工锌指核酸酶,以减少人工锌指核酸酶的毒性。采用OPEN电子设计方法,生物信息学方法的预测分析ZFP的立体结构,设计优化合适的连接体和间隔体组合,并通过突变优化Fok I异源二聚体。采用OPEN法设计三指ZF序列,并连接为ZFP序列,设计出长度为6 bp且富含AT碱基的spacer,加上长度为4个氨基酸残基的inter-domain linker,连接FokⅠ切割结构域双突变子异源二聚体,并通过各种软件工具对ZFN的空间结构进行模拟预测,所设计得到的ZFN的有效率超过50%。探索获得电子设计理想ZFN的方案,即特异性结合DNA的锌指蛋白、最佳的linker和spacer的长度与组合以及优化的特异性切割的Fok I异源二聚体切割结构域。
- 张勇蒋泓邓廷贤粟文俊杨莉珊唐冬生
- 关键词：锌指核酸酶锌指蛋白连接体
- 类转录激活因子效应物核酸酶介导的E-cad和Bmi-1基因联合干预鼻咽癌的体外研究被引量：8
- 2018年
- 目的:检测类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)介导的E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、B细胞特异性莫洛尼氏白血病毒插入位点1(B-lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion region-1,Bmi-1)基因联合干预对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。方法:构建多位点基因打靶载体p UC-DS1-E-cad-2ANeo-DS2(以下简称E-cad打靶载体)和p UC-DS1-Bmi-1 sh RNA-Zeo-DS2(以下简称Bmi-1打靶载体),将E-cad打靶载体、Bmi-1打靶载体及佛山科学技术学院分子医学研究院前期构建的TALEN载体以不同组合转染鼻咽癌CNE-2细胞。采用PCR检测靶基因的整合,Western印迹检测靶基因蛋白表达水平变化,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖能力变化,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡变化,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力变化。结果:靶基因E-cad和Bmi-1 sh RNA表达元件成功整合到鼻咽癌CNE-2细胞的基因组中;转染后鼻咽癌CNE-2细胞中E-cad的蛋白表达水平明显上升,Bmi-1的蛋白表达水平明显下降;干预E-cad及Bmi-1不影响细胞的增殖、周期和凋亡,但显著抑制细胞的迁移和侵袭能力,且E-cad和Bmi-1联合干预比单独干预更能显著抑制鼻咽癌CNE-2细胞体外迁移能力(均P<0.01)。结论:TALEN介导的E-cad和Bmi-1联合干预能有效抑制鼻咽癌CNE-2细胞的体外迁移和侵袭,可为人类癌症的基因治疗建立前期的实验基础。
- 罗婷婷严爱芬严爱芬刘连蒋泓冯翠兰刘芳刘芳周天鸿
- 关键词：鼻咽癌
- 人工锌指蛋白随机库的构建及其在锌指核酸酶筛选中的应用被引量：3
- 2012年
- 利用开源式(Oligomerized pool engineering,OPEN)方法筛选具有较高特异性和亲和性的锌指蛋白(Zinc finger protein,ZFP)。以已知三锌指蛋白为框架,使单个锌指关键位点氨基酸编码序列产生随机突变,构建3个人工锌指蛋白随机库,建立和完善应用人工锌指蛋白随机库筛选特异性锌指蛋白的技术平台。以人DYRK1A基因为例,测试和验证该技术平台的可行性和效率,分别获得对DYRK1A基因靶序列中左侧和右侧位点具有较高亲和性的50个三锌指蛋白;然后将得到的锌指蛋白与非限制性核酸内切酶FokⅠ连接,构建DYRK1A锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN),应用酵母验证系统测试DYRK1A锌指核酸酶的活性,结果表明,90%的组装锌指核酸酶能够在靶位点进行切割。
- 李战伟王昕任刚王令杨涵江张智英
- 关键词：锌指蛋白锌指核酸酶
- IL2R基因人工锌指核酸酶的设计、基因扩增及真核表达载体的构建
- 引言同源重组和反转录病毒介导转基因法是目前基因组修饰中常用的两种主要方法。由于这些传统方法的效率极低,特异性差等缺点,制约了其在研究中的应用。锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease,ZFN)是一种人工
- 王令李战伟张智英
- 关键词：基因扩增真核载体
- 文献传递
- 锌指核酸酶技术的应用被引量：1
- 2011年
- 锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技术是近年来发展起来的一种对基因组DNA实现靶向修饰的新技术。ZFN通过作用于基因组DNA上特异的靶位点产生DNA双链切口(double strand break,DSB),然后经过非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(homologous recombination,HR)途径实现对基因组DNA的靶向敲除或者替换。该技术近些年来已经被广泛应用于基因靶向修饰的研究。本文在简要介绍ZFN技术的基础上,重点综述了目前该技术在基因靶向修饰中的应用研究进展,并同时对该技术目前所需解决的一些问题以及未来的研究方向进行了分析。
- 张伟锋夏海滨
- 关键词：锌指核酸酶同源重组基因治疗
- 富含ω-3型多不饱和脂肪酸基因工程猪研究进展被引量：2
- 2019年
- 我国是世界第一大生猪养殖国,猪肉在我国肉类食品组成中占有重要地位,是国人获取动物蛋白的重要来源。猪肉中ω‐6多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)含量高,而ω‐3 PUFAs含量少,不利于人类健康。基因工程技术可以对特定DNA片段敲除、插入和替换,在改良猪生产性状方面具有巨大潜力,采用基因工程培育富含ω‐3 PUFAs猪具有巨大的市场价值。本文阐述了猪肉ω‐3 PUFAs含量少的原因,并就利用基因工程技术培育富含ω‐3 PUFAs猪的研究进展进行了分析,以期为提升猪肉ω‐3 PUFAs含量的相关研究与实践奠定基础。
- 魏妍妍詹群美朱向星唐冬生
- 关键词：猪肉多不饱和脂肪酸脂肪酸脱氢酶基因工程
- 锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶被引量：4
- 2012年
- 该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.
- 唐冬生蒋泓刘芳王克振张勇曾芳梁沂梅邓廷贤欧阳宏佳李月琴张细权周天鸿
- 关键词：锌指核酸酶基因打靶同源重组转基因动物基因治疗
