河北省自然科学基金(2007000858)
- 作品数：9 被引量：17H指数：2
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- 发文基金：河北省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 慢性粒细胞性白血病中SHIP1基因的表达变化及机制探讨被引量：10
- 2008年
- 目的观察SHIP1基因在慢性粒细胞性白血病(CML)患者中的表达变化,并通过特异性小干扰RNA(siRNA)封闭K562细胞株BCR-ABL基因的表达,探讨BCR-ABL基因表达对SHIP1基因的影响。方法应用RQ-PCR方法检测CML患者骨髓、正常人外周血白细胞及白血病细胞株K562中SHIP1基因表达的差异。另取K562细胞分为3组:空白对照组(不加任何干扰成分);非特异性siRNA处理组(加非特异性siRNA);特异性siRNA处理组(加入特异性siRNA封闭BCR/ABL融合基因),应用RQ-PCR及Western blot方法分别检测3组中BCR/ABL、SHIP1基因的mRNA及其相应蛋白P210(BCR/ABL编码)、P145(SHIP1基因编码)的表达,并比较各组中表达水平的变化。结果CML患者骨髓白细胞和K562细胞中SHIP1基因的表达明显低于正常人的外周血白细胞。特异性siRNA处理组中BCR-ABL基因mRNA和P210蛋白的表达水平明显下降,SHIP1基因mRNA和P145蛋白表达水平随BCR-ABL表达下降而增加;非特异性siRNA处理组与空白组相比无明显差异。结论CML患者SHIP1基因的表达低于正常人;特异性siRNA能够抑制BCR-ABL基因的表达;BCR-ABL基因能抑制SHIP1基因及其蛋白表达。
- 刘小军罗建民杨琳温树鹏姚丽杜行严杨敬慈董作仁
- 关键词：BCR/ABL基因
- SHIP基因突变对白血病细胞系K562细胞迁移及侵袭的影响被引量：2
- 2012年
- 目的 研究含SH2结构域的肌醇磷酸酶（SHIP）基因碳末端PxxP结构域点突变对细胞体外迁移及侵袭能力的影响及其机制.方法 采用基因转染技术将携带野生型（wt）和突变型（mu）SHIP基因的慢病毒载体感染人白血病细胞系K562细胞；采用实时荧光定量PCR（FQ-PCR）和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测转染后各组SHIP基因表达水平；采用Transwell小室比较K562/wtSHIP、K562/muSHIP转染后K562细胞跨膜及侵袭能力有无差别；Westem blot法比较各组细胞基质金属蛋白酶（ MMP）-2、MMP-9和磷酸化灶性黏着斑激酶（p-FAK）的表达情况,并检测各组细胞NF-KB活性改变.结果 感染慢病毒48 h后FQ-PCR和Westemblot法检测结果显示SHIP基因在K562细胞中表达明显升高；K562/wtSHIP组细胞迁移指数为（15.8±1.4）％,明显低于K562/muSHIP组[（54.3±2.4）％]和转染空载体的细胞对照组[K562/猫免疫缺陷病（pFIV）组,（50.3±3.8）％]（P＜0.01）；K562/muSHIP组与K562/pFIV组差异无统计学意义（P＞0.05）；侵袭实验显示K562/wtSHIP组迁移到碳酸脂膜的细胞[（32±6）/视野]较K562/pFIV细胞[（78±13）/视野]和K562/muSHIP细胞[（83±16）/视野]明显减低.而K562/pFIV细胞与K562/muSHIP细胞比较,在侵袭能力上差异无统计学意义（P＞0.05）.K562/muSHIP细胞p-FAK和NF-KB表达明显高于K562/wtSHIP细胞.结论 SHIP基因碳末端PxxP结构域对于SHIP基因负调节功能有重要作用.此位点发生突变通过影响FAK蛋白磷酸化、NF-KB活化以及MMP-9的表达影响K562细胞的体外迁移和侵袭能力；SH IP基因碳末端PxxP结构域点突变可能为致病性突变,可能是白血病细胞中SHIP功能异常的原因之一.
- 刘小军杨琳温树鹏姚丽杨敬慈罗建民
- 关键词：白血病基因SHIPK562细胞突变慢病毒感染
- 外源性肌醇5′磷酸酶对K562细胞增殖及凋亡的影响
- 2009年
- 目的通过慢病毒载体介导外源性5′肌醇磷酸酶(SH2domain contaihing inositol5′-phosphatase,SHIP)基因转染K562细胞,探讨ship基因对K562细胞生长增殖的影响。方法以白血病细胞株K562为研究对象,将携带ship基因的慢病毒感染K562细胞,FQ-PCR方法检测ship转录水平,Western blot方法检测转染后SHIP蛋白表达变化;比较ship基因表达前后细胞增殖、形态的变化。结果FQ-PCR和Western blot结果显示,携带ship基因的慢病毒载体pReceiver-Lv31能高效转染K562细胞,阳性率(74.6±5.8)%;细胞生长曲线显示SHIP可显著抑制K562细胞生长,抑制率(35.0±3.1)%;集落形成实验显示SHIP能显著抑制K562细胞集落形成能力[K562/SHIP组集落形成率(36.7±7.1)%,K562/FIV组为(77.7±6.3)%,(P<0.05)];细胞形态观察发现凋亡增加,TUNEL法证实SHIP蛋白促进细胞凋亡。结论外源性ship基因表达抑制白血病细胞系K562的增殖活性,并促进其凋亡。
- 杨琳罗建民杜行严杨敬慈刘晓军温树鹏成志勇
- 关键词：慢病毒载体细胞增殖细胞凋亡
- 肌醇5’磷酸酶基因突变对K562细胞周期蛋白和Akt磷酸化的影响
- 2009年
- 目的从分子水平探讨肌醇5’磷酸酶（SHIP）基因突变对人白血病细胞系K562细胞周期及其相关基因表达的影响。方法应用携带野生型和突变型SHIP及绿色荧光蛋白的慢病毒及空载体慢病毒质粒转染K562细胞，通过流式细胞术检测K562／SHIP细胞转染效率、细胞增殖指数及细胞周期变化；MTT法检测细胞增殖活性改变，实时荧光定量PCR（FQ—PCR）检测SHIPmRNA水平变化，Western blot检测各组K562细胞SHIP、细胞周期蛋白（cyclin）D1、p21^WAF1/CIPI、p27^KIP1蛋白表达水平及Akt磷酸化变化。结果野生型SHIP基因能明显抑制K562细胞增殖，并产生明显的G0／G1期阻滞[G0／G1期细胞分别为（34．2±7．8）％和（0．7±8．3）％，P〈0．01]；但SHIP基因点突变并未影响K562细胞增殖及细胞周期改变[G0／G1期细胞分别为（33．4±4．2）％和（36．3±6．7）％，P〉0．05]。Westernblot结果发现转染野生型SHIP基因后K562细胞Akt磷酸化和cyclin D1表达水平明显下降（P〈0．01），p21^WAF1/CIPI、p27^KIP1表达增高，而突变型SHIP基因对Akt磷酸化水平和细胞周期蛋白表达几乎没有影响（P〉0．05）。结论①野生型SHIP基因通过下调K562细胞Akt磷酸化水平，进而抑制其下游cyclinD1表达，上调p21^WAF1/CIPI和p27^KIP1基因表达，导致细胞周期阻滞在G0／G1期，抑制K562细胞增殖；②SHIP基因突变体（TTC→CTC，Phe→Leu）丧失了对K562细胞的增殖抑制作用，提示SHIP基因对K562细胞增殖的负调控作用有赖于其基因结构和功能正常。
- 杨琳罗建民刘小军温树鹏杨敬慈张敬宇
- 关键词：SHIPK562细胞细胞周期细胞周期蛋白D1
- 外源性SHIP基因对K562细胞周期及其相关蛋白表达的影响被引量：3
- 2009年
- 目的:探讨SHIP基因对人白血病细胞系K562细胞周期的调控作用。方法:用携带野生型SHIP基因及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的慢病毒及空载体慢病毒转染人白血病K562细胞。FCM检测转染效率、细胞凋亡率及细胞周期变化,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RFQ-PCR)检测SHIPmRNA水平的变化,Western印迹法检测SHIP、cyclinD1、p21WAF1/CIPI、p27KIP1蛋白表达水平的变化。结果:与转染空载体组和未转染组相比,转染野生型SHIP基因的K562细胞增殖减慢,凋亡率明显上升(P<0.05);细胞周期显示,G0/G1期延长,G1期前出现亚二倍体的凋亡峰,S期和G2/M期比例降低;cyclin D1表达降低,p21WAF1/CIPI和p27KIP1表达增加。结论:转染野生型SHIP基因可使细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制白血病细胞增殖,促进白血病细胞凋亡。
- 杨琳罗建民王福旭刘晓军温树鹏成志勇武学文杨晓阳
- 关键词：细胞周期细胞周期蛋白类K562细胞
- SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及对白血病细胞系K562的抑制作用
- 2009年
- 目的构建真核表达质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达。方法将SHIP基因的RT-PCR产物克隆入载体pCAG-IRES-GFP,经酶切、鉴定及测序分析,构建pCAG-IRES-SHIP-GFP重组真核表达质粒。实验设置3个组:K562组(未转染)、K562/IRES组(转染空载体pCAG-IRES-GFP),K562/SHIP组(转染重组质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP)。荧光显微镜和流式术检测重组质粒的转染效率;Western blotting检测各组SHIP蛋白的表达及Akt磷酸化水平变化;MTT法和流式术分析SHIP基因转染对细胞增殖的影响。结果重组质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP已成功载入SHIP的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜在K562/SHIP组可见绿色荧光,转染效率为48.2%±6.6%。Western blotting显示K562/SHIP组有明显的SHIP蛋白表达,且p-Akt-308和p-Akt-473的水平(分别为0.182和0.381)较K562/IRES组(0.361和0.716)和K562组(0.365和0.725)明显下降(P<0.01)。流式术分析显示K562/SHIP组细胞生长减慢,G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,增殖指数降低。结论成功构建了3 585bp的SHIP基因真核表达质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP,并在K562细胞中表达。外源性SHIP基因转染能使K562细胞增殖受抑,原因可能与Akt的磷酸化下调有关。
- 杨琳罗建民刘小军成志勇温树鹏杜行严杨晓阳武学文
- 关键词：转染质粒SHIP白血病K562细胞
- SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究被引量：1
- 2009年
- 构建真核表达载体pCAG-IRES-SHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达。将SHIP逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pCAG-IRES-GFP,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pCAG-IRES-SHIP-GFP重组真核表达载体;采用脂质体转染法将pCAG-IRES-SHIP-GFP及空载体转入K562细胞,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)、Westernblot方法检测转染前后K562细胞中SHIPmRNA和蛋白的表达及Akt磷酸化水平改变,MTT、流式细胞仪检测等方法观察野生型SHIP基因表达对白血病细胞K562凋亡的影响。结果显示重组后的pCAG-IRES-SHIP-GFP质粒已成功载入SHIP的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pCAG-IRES-SHIP-GFP的K562细胞中存在荧光分布。外源性SHIP基因表达能使K562细胞增殖受抑;Westernblot检测提示K562细胞Akt308和Akt473的磷酸化水平较转染前显著下调,分别为转染前的38.7%和36.8%(P<0.01)。上述结果表明基因全长3.5kb的人野生型SHIP基因真核表达载体质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP构建成功,并在K562细胞中表达;外源性SHIP基因表达能使K562细胞凋亡增加;这些改变可能与p-Akt表达下调有关。
- 杨琳罗建民刘小军成志勇温树鹏杜行严杨晓阳武学文
- 关键词：基因转染白血病K562细胞AKT磷酸化细胞增殖
- 外源性SHIP基因表达抑制生长因子介导的K562细胞增殖及Akt磷酸化
- 2009年
- 【目的】探讨SHIP基因对IL-3诱导K562细胞系增殖的抑制作用,阐明SHIP对K562细胞作用的机制。【方法】将慢病毒质粒pReceiver-Lv31-FIV和pReceiver-Lv31-SHIP转染K562细胞;转染细胞与IL-3共培养,Western blot法检测K562细胞Akt磷酸化;观察转染野生型SHIP基因对K562细胞增殖的影响;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺失末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡。【结果】重组慢病毒载体pReceiver-Lv31-FIV和pReceiver-Lv31-SHIP转染K562细胞,GFP阳性率为74.6%。野生型SHIP基因阻断了IL-3对K562细胞的增殖作用,对照组(K562/FIV)细胞增殖抑制率(3.26%)明显低于转染SHIP基因组细胞增殖抑制率(26.42%,P<0.05);集落形成实验显示SHIP能显著抑制K562细胞集落形成能力[IL-3作用组K562/SHIP细胞形成集落为60.3±6.6,明显低于IL-3诱导的K562/FIV组(91.7±4.2)](P<0.01)。细胞形态观察发现凋亡增加,Western blot检测发现转染SHIP基因组前凋亡酶pro-caspase-3降解增加,TUNEL法证实SHIP蛋白促进细胞凋亡。IL-3作用不同时间段(3h,6h,12h),转染野生型SHIP组细胞增殖明显减弱,且Akt磷酸化水平均低于对照组(P<0.05)。【结论】SHIP基因负调控生长因子(IL-3)介导的K562细胞增殖及其蛋白激酶活化。
- 杨琳罗建民温树鹏刘小军姚丽杨敬慈杜行严
- 关键词：基因细胞增殖磷酸化蛋白激酶B
- 慢病毒载体介导SHIP基因抑制K562细胞增殖及对PI3K/Akt信号通路的调控被引量：2
- 2009年
- 背景与目的:SHIP基因主要表达于造血细胞,通过降解PIP3抑制PI3K/Akt信号通路而在造血细胞增殖和存活中起重要负调控作用。本研究通过慢病毒载体介导SHIP基因转染K562细胞,探讨SHIP基因改变及功能丢失与白血病发病的关系。方法:将携带SHIP基因的慢病毒感染K562细胞,FQ-PCR法检测SHIP转录水平,Westernblot法检测转染后SHIP蛋白表达及Akt磷酸化水平的变化;比较SHIP基因表达前后细胞增殖、形态的变化。结果:K562细胞中SHIP蛋白阴性。以携带SHIP基因的慢病毒载体转染K562细胞后,细胞增殖抑制率升高,K562-wtSHIP-FIV-G细胞的增殖抑制率由转染第3天的(9.9±1.5)%升到第5天的(40.6±2.3)%;伴有Akt磷酸化水平明显减弱;转染后,K562-wtSHIP-FIV-G组细胞p-Akt的表达水平由0.533降低到0.245(P<0.01),细胞增殖明显被抑制。此外,SHIP蛋白还能使K562细胞出现凋亡特征,Hoechst33342染色结果转染wtSHIP基因组K562细胞第5天早期凋亡率[(38.3±4.3)%]明显高于K562-FIV-G组细胞[(8.2±0.9)%]和未转染组K562细胞[(7.7±0.8)%]。结论:SHIP基因具有重要的抑制细胞增殖和促进凋亡的能力,SHIP基因缺失导致K562细胞PI3K/Akt信号途径失调,促进K562细胞增殖。
- 杨琳罗建民刘小军温树鹏杜行严姚丽
- 关键词：慢病毒载体细胞增殖磷酸化蛋白激酶B
