卫生部科学研究基金(WKJ2008-2-51)
- 作品数：10 被引量：17H指数：3
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- 相关机构：福建医科大学福建师范大学第四军医大学西京医院更多>>
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- pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒的构建及其在体外人脐静脉内皮细胞中抑制Ang2/Tie2基因的表达
- 2011年
- 目的探讨应用RNA干扰(RNAi)技术抑制Ang2、Tie2基因的表达情况,为进一步研究其在体外抑制血管生成以及抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础。方法构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条并予以鉴定。用pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测各组HUVECs中Ang2及Tie2的蛋白及mRNA的表达状况。结果成功构建pSilencer 1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒各2条,用其转染HUVECs后,免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,Ang2、Tie2在蛋白和mRNA的表达水平均受到明显抑制(P<0.05),并且siRNA的2条重组质粒之间均差异无统计学意义(P>0.05)。结论 pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA在体外能够抑制HUVECs的Ang2和Tie2的蛋白及mRNA的表达。
- 王彪郭国祥林菊丽单秀英张声鲁开化
- 关键词：促血管生成素2质粒载体脐静脉内皮细胞
- Ang2、Tie2基因的RNA干扰及其在体外抑制血管生成的作用被引量：6
- 2010年
- 目的:探讨应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Ang2、Tie2基因及其在体外抑制血管生成的研究,为将来进一步进行抑制肿瘤血管生成的动物实验研究奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。方法:用pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),采用RT-PCR检测各组HUVECsAng2、Tie2的mRNA表达状况。应用体外血管生成的三维培养模型研究转染后的HUVECs在体外形成血管样结构的情况。结果:pSilencer1.0-U6-Ang2/Tie2-siRNA重组质粒转染HUVECs后,RT-PCR检测结果显示:Ang2、Tie2基因mRNA的表达水平均受到明显抑制(P<0.05),并且siRNA的2条重组质粒之间均无明显差别(P>0.05)。转染后的HUVECs在体外三维培养模型中血管样结构形成的数量和长度均明显减少(P<0.05),表明血管生成受到明显抑制。结论:Ang2-siRNA、Tie2-siRNA能够抑制HUVECs中Ang2和Tie2的mRNA表达,从而在体外抑制血管生成。
- 王彪刘照亮林菊丽单秀英王美水张声鲁开化
- 关键词：RNAI血管生成
- 靶向Ang2的RNAi慢病毒载体的构建及其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的影响被引量：2
- 2011年
- 目的 构建携带促血管生成素2-小干扰RNA（Ang2-siRNA）慢病毒载体,观察其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的干扰作用.方法 将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的带有加强绿色荧光蛋白的转移质粒（pNL-EGFP）载体与pSilencer 1.0-U6启动子-促血管生成素2-小干扰RNA（pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA）重组质粒连接,产生加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅰ（pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ）、加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅱ（pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ）慢病毒转移质粒,电泳筛选阳性克隆,测序鉴定.用连接成功的慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白（pVSVG）包膜质粒和pHelper包装质粒共转染293T细胞,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒.收集病毒上清,测定病毒滴度.将收集的病毒上清感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR测定抑制Ang2基因表达的效率.结果 酶切电泳与测序鉴定证实成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,293T细胞测定病毒原液滴度为8.0×103/ml.实时荧光定量RT-PCR结果显示：Ang2-siRNA慢病毒载体感染恶性黑色素瘤细胞,抑制了恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因的表达（P＜0.05）.结论 成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,体外研究显示Ang2-SiRNA慢病毒载体能抑制恶性黑色素瘤细胞中Ang2 mRNA的表达,为下一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的干预实验奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据.
- 刘照亮王彪郭国祥单秀英王美水庄福连蔡传书张明凤张彦定
- 关键词：RNA干扰ANG2慢病毒载体恶性黑色素瘤
- Ang2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定被引量：2
- 2011年
- 目的构建促血管生成素(Ang)2基因的RNAi慢病毒表达载体,并鉴定其正确性。方法将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA重组质粒与经XbaⅠ酶切电泳鉴定的嗜中性多形核白细胞-绿色荧光蛋白转移质粒(pNL-EGFP)载体连接,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-siR-NA慢病毒转移质粒,再以pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白包膜质粒和包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Ang2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,证明Ang2-siRNA核苷酸序列插入的正确性。利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Ang2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Ang2基因的RNAi慢病毒表达载体,为下一步进行干扰体内外恶性黑素瘤Ang2的表达奠定基础。
- 王彪张炜强单秀英刘照亮郭国祥庄福连
- 关键词：RNA干扰促血管生成素2慢病毒载体质粒载体
- APES处理的载玻片在原位杂交技术中的应用
- 2011年
- 目的:获得一种廉价的、核酸酶(RNase)处理效果好的载玻片运用于原位杂交技术中。方法:改进传统APES(3-Aminopropyl triethoxysilane)方法处理载玻片,加入载玻片高温烘烤、丙酮稀释APES等步骤,以去除RNase污染,并将处理好的载玻片分别进行冰冻和石蜡组织贴片,用原位杂交试验进行验证。结果和结论:原位杂交结果显示两种组织贴片效果良好,组织未出现掉片,RNA信号特异,与进口载玻片没有差异。因此,改进APES方法处理的载玻片完全能够运用于原位杂交技术中,可大大节约试验成本。
- 滕鸿琦施珏平肖爱平李小兵张明凤
- 关键词：APES石蜡切片冰冻切片原位杂交
- Ang2-siRNA慢病毒干预裸鼠移植性恶性黑色素瘤的研究
- 2012年
- 目的研究血管生成素2小干扰RNA（Ang2-siRNA）对裸鼠移植性恶性黑色素瘤血管形成及其生长的影响。方法建立人恶性黑色素肿瘤裸鼠异种移植瘤模型。在体内使用pNL-EGFP—Ang2-siRNA慢病毒干扰裸鼠移植性恶性黑色素瘤Ang2基因的表达，观察统计各组肿瘤（空白组、空载组、实验组）生长情况。应用实时荧光定量RT—PCR检测肿瘤组织中Ang2基因的mRNA表达水平；CD34单克隆抗体作为血管内皮标志物，免疫组织化学法检测其表达，以评价肿瘤微血管密度。结果成功建立了恶性黑色素瘤裸鼠异种移植瘤模型，实验组肿瘤Ang2基因mRNA水平、微血管密度、肿瘤体积显著小于空白组和空载组（P〈0．01），空白组和空载组之间无统计学意义（P〉0．05）。结论pNL—EGFP—Ang2-siRNA慢病毒能沉默Ang2的表达，显著抑制恶性黑色素瘤血管的形成和肿瘤的生长，可能为临床恶性黑色素肿瘤的基因治疗开辟新的途径。
- 王彪林建鸿张炜强张明凤刘照亮单秀英王美水庄福连
- 关键词：促血管生成素2恶性黑色素瘤血管生成
- let-7 microRNA调控动物器官发育的研究进展被引量：8
- 2011年
- 微小RNA(microRNA,miRNA)是一类在进化上高度保守、长度约20～24 nt的小分子非编码RNA,能通过与靶基因3′非翻译区相结合从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因。let-7 microRNA是发现较早的一类miRNA,最早在线虫中发现能调控细胞分裂的时序。此后大量证据表明,let-7参与动物多个器官发育的调控过程,并与人类疾病发生密切相关。该文综述了近年来let-7调控动物脑、神经及心肺系统等器官发育的研究成果,初步阐述了let-7调控动物器官发育可能的作用机制,以期为深入研究let-7的功能奠定基础。
- 王虹滕鸿琦施珏平张彦定张明凤
- 关键词：MICRORNALET-7器官发育
- 促血管生成素2及其受体Tie2基因RNA干扰表达载体的构建与鉴定被引量：7
- 2009年
- 目的构建促血管生成素2(Ang-2)及其受体Tie2基因的RNA干扰(RNAi)表达载体。方法以Ang-2、Tie2的mRNA已知序列为靶点,化学合成能编码针对Ang-2、Tie2基因的短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸各2对,退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6-siRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ启动子的下游,构建重组质粒pSliencer-1.0-U6-Ang-2/Tie2-siRNA。结果将与目的片段相符的双链shRNA和线性化的pSilencer1.0-U6-siRNA质粒连接后,经限制性内切酶HindⅢ酶切电泳及测序分析证实,2条重组质粒载体构建正确,无任何碱基突变。结论成功构建pSilencer1.0-U6-Ang-2/Tie2-siRNA重组质粒各2条,为进一步研究其对血管生成的作用打下基础。
- 王彪单秀英林菊丽庄福连鲁开化
- 关键词：RNA干扰促血管生成素2重组质粒
- Tie2基因RNAi慢病毒载体的构建及其干预恶性黑色素瘤细胞的体外研究
- 2011年
- 目的 构建携带酪氨酸蛋白激酶受体2-小干扰RNA（Tie2-SiRNA）慢病毒载体,观察其对恶性黑色素瘤细胞的干扰作用.方法 将pSilencer 1.0-U6启动子-酪氨酸蛋白激酶受体2-小干扰RNA（pSilencer 1.0-U6-Tie2-siRNA）重组质粒经Xba Ⅰ酶切电泳鉴定后,与经Xba Ⅰ酶切电泳鉴定的带有加强绿色荧光蛋白的转移质粒（pNL-EGFP）载体连接,产生加强绿色荧光蛋白的转移质粒-u6启动子-酪氨酸蛋白激酶受体2-Ⅰ（pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅰ）、pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅱ慢病毒转移质粒,电泳筛选阳性克隆,测序鉴定.用连接成功的慢病毒转移质粒,分别与水疱性口炎病毒G蛋白（pVSVG）包膜质粒和pHelper包装质粒组成慢病毒三质粒转染系统,再共转染293T细胞,产生pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Tie2-Ⅱ慢病毒.收集病毒上清,测定病毒滴度.将收集的病毒上清感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR测定抑制Tie2基因表达的效率.结果 酶切电泳与测序鉴定证实成功构建了Tie2-SiRNA慢病毒载体,293T细胞测定病毒原液滴度为8.8×103/ml.实时荧光定量RT-PCR结果显示：Tie2-SiRNA慢病毒载体感染恶性黑色素瘤细胞,抑制了恶性黑色素瘤细胞中Tie2基因的表达,其中较高者可达68.55%,并且2种慢病毒载体之间差异无统计学意义（t=0.362,P＞0.05）.结论 成功构建了Tie2-SiRNA慢病毒载体,体外研究显示其能抑制Tie2 mRNA的表达,为下一步进行抑制肿瘤生成的动物实验研究奠定了基础.
- 单秀英刘照亮王彪郭国祥王美水庄福连蔡传书张明凤张彦定
- 关键词：慢病毒载体黑色素瘤
- Tie2基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定
- 2011年
- 目的构建并鉴定Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法先构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,通过XbaⅠ酶切电泳及测序鉴定,再以pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒,pVSVG包膜质粒和pHelper包装质粒三质粒共转染293T细胞,产生慢病毒,收集病毒上清液并测定病毒滴度。结果成功构建pNL-EGFP-U6-Tie2-siRNA慢病毒转移质粒2条,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定,Tie2-siRNA核苷酸序列插入正确,利用三质粒慢病毒包装系统生产EGFP-Tie2-siRNA病毒,收集病毒上清,并测得病毒滴度为9×103/μL。结论成功构建了Tie2基因的RNA干扰慢病毒表达载体。
- 郑厚兵单秀英刘照亮王彪郭国祥张炜强庄福连
- 关键词：RNA干扰促血管生成素2TIE2受体慢病毒载体质粒载体
