国家重点基础研究发展计划(2004CB719600)
- 作品数：18 被引量：86H指数：5
- 相关作者：何冰芳邵蔚蓝彭惠毛忠贵叶艳华更多>>
- 相关机构：南京工业大学江南大学南京师范大学更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学化学工程医药卫生理学更多>>
- 嗜热乙醇杆菌中醛/醇脱氢酶的双启动子分析被引量：1
- 2007年
- 克隆了嗜热乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)中乙醇代谢的关键酶之一醛/醇脱氢酶(alcohol/acetaldehydedehy drogenase,AdhE)基因的上游假定启动子序列,并进行了结构分析。结果表明,adhE的上游序列是启动子,能启动报告基因在大肠杆菌中持续表达。首次发现adhE的启动子序列中存在两个独立的启动子(P172和P37)和核糖体结合位点(SD172和SD37),分别都具有完整功能,但其活性均低于完整的启动子序列。由此推测嗜热乙醇杆菌中adhE的表达受这两个启动子协同调控。
- 彭惠毛忠贵武国干邵蔚蓝
- 关键词：启动子报告基因系统
- 嗜热厌氧乙醇菌JW200转化条件的研究被引量：5
- 2006年
- 嗜热厌氧乙醇菌遗传转化系统的缺少,制约了对该菌理论基础和应用领域的进一步研究。利用聚乙二醇(PEG6000)转化和电转化技术,国际上首次实现了嗜热厌氧乙醇菌JW200外源基因的导入。PEG转化效率很低,因此选择对电转化条件进行优化,转化效率从4±3.2个转化子/μg质粒DNA提高到50±7.4个转化子/μg质粒DNA。实验表明获得较高的转化效率的必要条件是在细胞密度为OD6600.2时添加甘氨酸与蔗糖后,继续培养2h以及细胞在电击前的收集与洗涤保持低温。实验为利用基因工程手段改造嗜热厌氧乙醇菌,从分子水平研究胞内乙醇代谢途径奠定了基础。
- 彭惠傅百灵毛忠贵邵蔚蓝
- 关键词：电转化
- 嗜热厌氧乙醇杆菌组氨酸融合双活性乙醇脱氢酶的克隆、表达和酶学性质被引量：1
- 2006年
- 乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶是嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus乙醇代谢途径中的关键酶。根据高同源性的NADP(H)依赖型Ⅱ型乙醇脱氢酶(S-ADH)的序列设计引物,从T.ethanolicusJW200基因组中PCR扩增出编码S-ADH的基因,插入带组氨酸标签的pET-20(b),测序获得基因大小为1 059 bp,并在大肠杆菌JM109(DE3)中表达。表达产物经Ni亲和柱提纯达电泳纯。带组氨酸标签的重组NADP(H)依赖型乙醇脱氢酶具乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶双活性,能将乙酰辅酶A转化成乙醇.带组氨酸标签的重组酶酶学性质为乙醛脱氢酶活性最适值为pH 8.4,最适温度70℃;乙醇脱氢酶活性正、逆反应分别最适pH 8.0,最适T 55℃;最适pH8.9,最适为T 60℃。以乙酰辅酶A(Aceyl-CoA)为底物,该酶的Km为3.32 mmol/L,Vmax为12.5μmol/(min.mg)。T.ethanolicusJW200中双活性S-ADH的首次发现,建立了该菌乙醇代谢途径中从乙酰辅酶A到的乙醇的另一条通路。
- 蒋宇邵蔚蓝
- 关键词：乙醛脱氢酶乙醇脱氢酶
- 耐有机溶剂极端微生物及酶类与天然产物的生物转化被引量：7
- 2007年
- 非水相催化在天然产物的生物转化中可显著提高非极性底物溶解度,大幅度提高转化特异性和生产率等优点,使生物转化工艺更具实用价值。本文探讨了耐有机溶剂极端微生物及酶类在天然药物生物转化中催化体系,新型耐有机溶剂极端微生物及酶类的筛选与应用,及现有非水相天然产物生物转化的研究现状,并指出融合非水相催化技术是天然产物开发的一个重要突破点,为中药现代化提供理论指导。
- 吴薛明何冰芳
- 关键词：生物转化
- 耐有机溶剂脂肪酶产生菌的筛选及其酶学性质被引量：4
- 2009年
- 以体积分数10%的甲苯等有机溶剂为筛选压力,从油污和污水等样品中筛选到一株产耐有机溶剂脂肪酶的有机溶剂耐受菌LX1,经16 S rDNA序列分析,该菌株鉴定为Pseudomonas aeruginosa。研究发现菌株LX1所产脂肪酶最适反应pH和温度分别为7.0和40℃,在较宽的pH范围内（6.5～10.5）具有较高的稳定性;金属离子鏊合剂EDTA和Ba^2＋、Ca^2＋对LX1脂肪酶活力均有明显的激活作用,推测该脂肪酶为金属激活酶。LX1脂肪酶在体积分数25%的疏水性和亲水性有机溶剂中均具有较好的耐受性,在十六烷、十四烷、十二烷、正庚醇、正辛醇和正己醇体系中半衰期显著延长到10 d以上,在DMF和DMSO体系中的半衰期为5 d以上,均高于在无溶剂体系中的半衰期。展现了LX1脂肪酶在有机相生物催化中的良好应用前景。
- 肖素静曹艳孙磊何冰芳
- 关键词：脂肪酶
- 极端嗜盐古生菌(Natrinema sp.)R6-5胞外嗜盐蛋白酶的纯化和性质研究被引量：18
- 2007年
- 采用bacitracin-Sepharose 4B亲和层析的方法得到凝胶电泳均一的来自极端嗜盐古生菌(Natrinema sp.)R6-5的胞外嗜盐蛋白酶。经SDS-PAGE分析该酶亚基分子量为62kDa。PMSF对它的活性完全抑制,表明它是一种丝氨酸蛋白酶,该酶反应的最适NaCl浓度为3mol/L,最适温度为45℃,最适pH值为8.0。在高盐条件下能维持高活性并十分稳定,具有重要的潜在应用价值。
- 石万良钟传奇唐兵沈萍
- 关键词：嗜盐古生菌纯化
- 极耐热性β-葡萄糖醛酸酶的高效表达和酶学性质及其应用被引量：10
- 2008年
- 从海栖热袍菌克隆出编码热稳定性β-葡萄糖醛酸酶基因,以热激载体pHsh为表达质粒,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过一步热处理后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶酶学性质研究表明,β-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80oC,最适反应pH为5.0,pH5.8～8.2之间酶的稳定性较好,80oC的半衰期为2h,SDS-PAGE结果显示分子量为65.9kD,与理论推算值相吻合。以对硝基苯-β-葡萄糖醛酸苷(pNPG)为底物时,其动力学参数Km值0.18mmol/L,Vmax值为312u/mg。初步的应用分析表明,该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸。
- 王卓裴建军李华钟邵蔚蓝
- 关键词：Β-葡萄糖醛酸酶甘草酸甘草次酸
- 973项目“极端微生物及其功能利用的基础研究”研究进展被引量：13
- 2006年
- 张敏东秀珠
- 关键词：极端微生物
- 柠康酸培养体系对A.pascens DMDC12的胁迫作用与其SOD活性的提高被引量：3
- 2006年
- 研究报道了野生型高度耐盐节杆菌Arthrobacter pascens DMDC12）经柠康酸体系培养后，导致胞内超氧化物歧化酶（SOD）大量表达．该菌的无细胞粗酶液SDS—PAGE表明，随着培养过程中碳源柠康酸的利用，亚基相对分子质量约为25000处的蛋白产生了显著诱导．经N-末端测序表明该蛋白为SOD，无细胞粗酶液酶活可达787U／g湿菌体．4种不同培养体系对该菌SOD活性影响表明，常规的葡萄糖、酵母膏或柠檬酸作为碳源或能源时，菌体的SOD处于较低水平，发酵液pH呈碱性可对该菌SOD有一定促进作用．在柠康酸培养体系中，无细胞粗酶液SOD的比活为常规培养基培养后的2．3—4．3倍，表明除pH外尚存在其他因素比如某种中间代谢物对菌体产生的胁迫压力显著促进了SOD的表达．本研究首次报道微生物生长环境胁迫作用对菌体SOD活力的影响，相关结论对利用微生物生存胁迫手段促进菌体大量产生SOD具有重要的指导作用．
- 刘妮娜方民叶艳华何冰芳
- 关键词：节杆菌超氧化物歧化酶环境胁迫
- 耐盐节杆菌Arthrobacter pascens DMDC12中Mn-SOD的纯化及性质被引量：5
- 2008年
- 作者从自行分离的高度耐盐菌Arthrobacter pascens DMDC12中分离提取超氧化物歧化酶（SOD），粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sapharose FF及Source 15Q柱层析，获得了电泳纯的SOD。其亚基相对分子质量23300，比活力为2183U／mg，纯化倍数为53，回收率51％。根据SOD同功酶对抑制剂氯仿：乙醇和H2O2的敏感性，判断其为Mn—SOD。金属离子Mg^2＋、Zn^2＋、Ba^2＋、Cu^2＋对酶产生一定抑制，Fe^2＋对酶产生显著的抑制，0．5mmol／L的Mn抖对酶有激活作用，进一步证实该酶为Mn—SOD。该酶在45℃以下、PH5～9范围内显示较好的稳定性。相关研究进一步验证了极端微生物是Mn-SOD的重要酶源。
- 刘妮娜姚忠叶艳华方民何冰芳
- 关键词：MN-SOD纯化
