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pEGFP-N1-heNOS重组质粒的构建与鉴定被引量：2: 2007年; 目的:构建pEGFP-N1-heNOS真核表达重组质粒。方法:应用基因重组手段,根据人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)基因序列和表达载体pEGFP-N1质粒上的多克隆位点设计了1对引物,对含有heNOS基因的质粒pBluescript Ⅱ SK-heNOS进行了PCR扩增,得到了约3.6kbp的目的片段。将其插入到载体启动子下游,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因融合,重组质粒经菌液PCR、限制性内切酶酶切和测序进行鉴定。结果:用PCR方法成功从质粒pBluescriptⅡSK-heNOS中扩增出heNOS基因片段,经菌液PCR、酶切及测序鉴定,heNOS基因成功插入到载体pEGFP-N1质粒中,插入目的基因的真核表达载体的酶切图谱与预期一致,并且heNOS基因与Genbank所提供的序列完全一致。结论:成功构建了pEGFP-N1-heNOS真核表达重组质粒。; 王国栋郭连瑞谷涌泉李建新汪忠镐张建; 关键词：绿色荧光蛋白真核表达质粒基因重组

骨髓刺激后骨髓干细胞移植治疗下肢缺血的研究进展被引量：1: 2009年; 自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血的研究是近年来令人关注的领域,取得一定的进展,但疗效有待进一步提高。骨髓刺激后自体骨髓干细胞移植治疗肢体缺血取得了较好的疗效;同时它具有抽取骨髓血少、获得细胞量多且安全性高的优点。但其具体作用机理尚不十分明确。内皮祖细胞数量的增加与质量的提高、局部微环境的改变可能是骨髓刺激后自体骨髓干细胞移植促进肢体缺血改善的机制。; 佟铸谷涌泉李建新张建; 关键词：干细胞移植下肢缺血

骨髓动员对大鼠骨髓源内皮祖细胞功能的影响被引量：2: 2008年; 目的观察大鼠骨髓动员后骨髓源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)功能的改变,探讨骨髓动员后骨髓干细胞移植提高下肢缺血性疾病疗效的可能机制。方法按是否接受重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulatory factor,rhG-CSF)注射液注射将Lewis大鼠分为动员组和对照组,获取骨髓单个核细胞用EBM-2培养液进行诱导分化,培养7d后对贴壁细胞进行EPCs的鉴定;采用黏附能力测定实验观察EPCs的黏附能力。另取Lewis大鼠制备单侧后肢缺血模型,在模型制备后7d将8×106个EPCs移植至缺血侧后肢的肌肉内,按照移植EPCs来源不同将后肢缺血大鼠分为动员组和对照组。EPCs移植4周后行后肢血管造影,计算缺血侧后肢侧支血管数目。结果大鼠骨髓单个核细胞培养7d后黏附能力测定实验中动员组黏附EPCs数量为(22.3±2.8)个/×100高倍视野大于对照组(16.8±4.4)个/×100高倍视野(P<0.05);大鼠骨髓源EPCs移植至缺血肢体后4周动员组EPCs移植后缺血侧后肢侧支血管数目为(4.7±1.0)大于对照组(3.3±0.5)(P<0.05)。结论骨髓动员使骨髓源EPCs功能改善,其可能是骨髓动员后骨髓干细胞移植提高下肢缺血性疾病疗效的机制之一。; 佟铸张建李建新谷涌泉陈兵罗涛杨盛家张淑文汪忠镐; 关键词：骨髓动员内皮祖细胞

骨髓单个核细胞和骨髓源内皮祖细胞移植促进血流重建的比较研究被引量：3: 2009年; 目的比较骨髓单个核细胞(MNCs)和骨髓源内皮祖细胞(EPCs)移植促进血流重建的效果,探讨非内皮祖细胞在血流重建中的作用。方法获取Lewis大鼠骨髓MNCs,部分MNCs在体外诱导分化为EPCs。采用Lewis大鼠建立单侧后肢缺血模型。建模后3 d,将模型鼠随机分为3组:(1)对照组(n=6),将0.8 mL D-Hank′s液注入对照组大鼠缺血侧后肢;(2)MNC组(n=6),将8×106个骨髓MNC植入MNC组大鼠缺血侧后肢;(3)EPC组(n=6),将体外培养的8×106个EPC植入EPC组大鼠缺血侧后肢。细胞移植后3周行大鼠后肢动脉造影,检测缺血侧后肢侧支血管数;切取缺血侧后肢腓肠肌,分别行CD31和α-SMA免疫组化染色,计算毛细血管密度和小动脉密度。结果MNC组毛细血管密度与EPC组差异无统计学意义[(31.67±7.87)个/HP vs.(32.83±5.38)个/HP,P>0.05],而均高于对照组(19.67±4.80个/HP)(P<0.05);MNC组侧支血管数与EPC组差异无统计学意义[(4.17±0.75)个vs.(4.50±1.38)个,P>0.05],但均高于对照组[(2.50±1.5)个](P<0.05);MNC组小动脉密度与EPC组差异无统计学意义[(4.83±1.47)个vs.(5.50±2.35)个,P>0.05],亦均高于对照组[(2.17±0.98)个](P<0.05)。结论在骨髓干细胞移植治疗肢体缺血性疾病中,非内皮祖细胞在血流重建中所起的作用与EPC相似。; 佟铸谷涌泉李建新罗涛张淑文张建; 关键词：骨髓单个核细胞内皮祖细胞细胞移植血流重建

骨髓刺激对大鼠骨髓源内皮祖细胞的影响被引量：1: 2008年; 目的观察大鼠骨髓刺激后骨髓源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量和功能的改变,探讨采用骨髓刺激后骨髓干细胞移植提高下肢缺血性疾病疗效的可能机制。方法取12只SPF级雄性Lewis大鼠,体重200～250g,按是否皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子注射液分为刺激组和对照组(n=6)。取骨髓单个核细胞用EBM-2培养液进行诱导分化,培养7d后对贴壁细胞采用异硫氰酸荧光素-荆豆凝血素1和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白染色进行EPCs鉴定及计数;同时采用黏附能力测定实验观察EPCs的黏附能力。另取12只SPF级雄性Lewis大鼠制备单侧后肢缺血模型,在模型制备后3d将8×106个EPCs移植至缺血侧后肢的肌肉内,按照移植EPCs来源不同将后肢缺血大鼠分为刺激组和对照组(n=6)。EPCs移植3周后行后肢血管造影,计算缺血侧后肢侧支血管数目。结果大鼠骨髓单个核细胞培养7d后刺激组EPCs数量为(145.2±37.0)个/HP,大于对照组(95.2±39.4)个/HP(P<0.05);刺激组黏附EPCs数量为(21.8±4.3)个/HP,大于对照组(15.0±5.2)个/HP(P<0.05)。大鼠骨髓源EPCs移植至缺血肢体后3周,刺激组EPCs移植后缺血侧后肢侧支血管数目为(4.2±1.2)个,大于对照组的(2.7±0.8)个(P<0.05)。结论骨髓刺激使骨髓源EPCs数量增加、功能改善,可能是骨髓刺激后骨髓干细胞移植提高下肢缺血性疾病疗效的机制之一。; 佟铸谷涌泉张建李建新张淑文汪忠镐; 关键词：重组人粒细胞集落刺激因子内皮祖细胞细胞移植

鼠胚胎干细胞诱导分化内皮样细胞被引量：1: 2009年; 目的采用简单贴壁培养方法诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)分化为内皮样细胞,为组织工程血管及细胞替代治疗提供新的种子细胞。方法小鼠ESC株SV129按2×104个/cm2密度传代培养,采用ESC培养基添加1000U/mL白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor,LIF)维持其未分化状态。撤除LIF,ESC悬浮培养形成拟胚体(embryoid body,EB),将培养第4天的EB置于含VEGF的培养基中贴壁培养,诱导分化。采用免疫组织化学染色、流式细胞仪分析、DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethylindocarbocyanine-labeledacetylated low density lipoprotein,DiI-Ac-LDL)摄取实验以及透射电镜检查鉴定分化细胞的性质。结果分化产生的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,能摄取DiI-Ac-LDL。ESC诱导分化培养产生的第15代细胞免疫组织化学染色呈Flk-1和CD31阳性;流式细胞仪检测ESC传至9代后CD31阳性细胞>90%;透射电镜可见怀布尔-帕拉德体及内皮细胞间紧密连接。结论采用简单贴壁培养的方法,单独使用VEGF即可诱导ESC分化为内皮样细胞。诱导培养方法操作简便,经济实用,可为组织工程血管及细胞替代治疗提供所需内皮样细胞。; 张斌谷涌泉佟铸杨盛家郝立松张淑文汪忠镐; 关键词：组织工程血管胚胎干细胞诱导分化内皮样细胞小鼠

自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血的中期疗效被引量：28: 2009年; 目的总结自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢缺血的中期疗效。方法2003年3月-2005年6月,采用自体骨髓单个核细胞移植治疗65例下肢缺血患者。男50例,女15例;年龄36～89岁,平均66.5岁。病变类型:单纯动脉硬化闭塞症4例,血栓闭塞性脉管炎5例,糖尿病下肢缺血56例。于患者髂后上棘抽取骨髓血400mL,分离骨髓单个核细胞。12例移植治疗2～4次,其余均为单次移植治疗。每次移植细胞数为(0.60～1.80)×109个,平均1.05×109个。根据下肢缺血临床症状改善程度行疗效评价。结果患者均获随访,随访时间8～56个月,平均21.5个月。随访期内5例死于心肌梗死和心衰,3例死于脑梗死。患者治疗有效率为70.8%(46/65),无效率为18.5%(12/65),复发率为10.7%(7/65)。疗效维持时间>12个月者42例,占总有效患者的91.3%(42/46);疗效维持>24个月者24例,占52.2%(24/46);疗效维持>37个月者12例,占26.1%(12/46)。12例多次治疗者有效率为100%,53例单次治疗者有效率为64.2%,差异有统计学意义(P<0.001)。结论中期随访结果表明,自体骨髓单个核细胞移植是一种临床可行和简便有效治疗下肢缺血的方法。; 谷涌泉齐立行张建郭连瑞李建新张淑文俞恒锡李学锋崔世军陈兵吴英锋佟铸汪忠镐; 关键词：下肢缺血自体骨髓单个核细胞细胞移植中期疗效

自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血的中期疗效: 目的了解自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血的中期疗效。方法2003年3月～2005年6月,采用自体骨髓干细胞移植治疗下肢缺血患者65例。移植单个核细胞的总数为0.6～1.8×109,平均为1.05×109。移植2-4次为12...; 谷涌泉张建汪忠镐; 关键词：细胞移植自体骨髓干细胞下肢缺血中期疗效; 文献传递

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北京市自然科学基金(7072031)

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