抗肿瘤药物疗效的研究多集中在肿瘤细胞,目前针对正常细胞的研究颇少,有必要建立能进行定量分析的同源重组定量修复体系。我们已建立的模型可以探讨肿瘤药物化疗后对HEK293细胞DSBs修复的继发性后果。通过构建含有带I-SceⅠ酶切位点的同源介导的重组修复底物(homologous direct recombination,HDR),或单链退火修复(single strand annealing,SSA)底物的细胞株,定量检测依托泊苷(etoposide,VP-l6)对同源性重组修复(homologous recombination,HR)通路的影响。成功构建了可用于定量检测DNA双链断裂(double-strand break,DSBs)诱导的SSA和HDR修复的正常人HEK293细胞应用模型。细胞毒结果证实,与SSA/293对照组对比,VP-16给药组16μmol/L(0.475±0.029 vs 1.000±0.000,P<0.001)细胞活力明显降低;与HDR/293对照组相比,VP-16给药组16μmol/L(0.458±0.188 vs 1.000±0.000,P<0.05)细胞活力降低。此外,本研究证实,VP-16抑制SSA修复,VP-16给药组2μmol/L与SSA/293对照组相比(0.575%±0.177%vs 1.352%±0.195%,P<0.05),修复效率降低;VP-16抑制HDR修复,VP-16给药组1μmol/L与HDR/293对照组修复效率相比(0.305%±0.078%vs.0.635%±0.049%,P<0.05),修复效率降低。VP-16诱导DNA损伤的同时,抑制HDR修复和SSA修复,修复效率呈现剂量依赖性。本研究结果可为抗肿瘤药物的临床应用提供某些指导。
目的建立含p I-SCEⅠ酶切位点的总的非同源末端连接(total non-homologous end joining,Total-NHEJ)和非经典末端连接(alternative end joining,A-EJ)修复底物的细胞株,设置特定的流式细胞术参数,定量检测依托泊苷(etoposide,VP-16)对非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复的影响。方法本实验通过脂质体转染含修复底物的质粒,嘌呤霉素筛选,构建起NHEJ修复系统的稳定细胞株;运用流式细胞术和PCR技术对所构建的细胞株的基因组DNA进行分析与鉴定;运用细胞免疫荧光及基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测VP-16诱导的DNA双链断裂(DNA double strand break,DSB)损伤,运用流式细胞术定量检测VP-16对NHEJ修复的影响。结果在所筛选的细胞中的各得到2株阳性细胞株Total-NHEJ和2株阳性细胞株A-EJ。VP-16作用浓度和时间的增加,Total-NHEJ和A-EJ修复效率增加。结论 VP-16诱导DNA损伤的同时,促进总NHEJ修复和A-EJ修复,修复呈现剂量和时间依赖性,但随着浓度和作用时间的增加,VP-16致DSB的损伤能力超过修复能力。
