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体外两种方式培养的肠神经干细胞生物学特性比较被引量：1: 2015年; 目的:对纤维连接蛋白(FN)包被和未包被两种方式培养的肠神经干细胞进行生物学特性比较,探索肠神经干细胞体外扩增合适的培养方式。方法:从孕15 d SD胎鼠肠管分离出肠神经干细胞,用FN包被和不包被两种方式原代培养第5天的神经球,通过形态学、免疫荧光细胞化学及流式细胞仪检测对其生长状态、增殖及分化能力进行比较。结果:与包被组相比,未包被组的原代培养第5天的神经球呈半贴壁生长,球体形态较规则,球体中央开始变黑,神经球周边未形成大量放射状的神经丝;荧光镜下发现2组原代神经球的Nestin、Brd U都显阳性;包被组的球体周围放射状神经丝Tuj-1显阳性。流式细胞仪检测结果显示,与包被组的(12.67±2.16)%相比,未包被组的Nestin阳性细胞百分比显著增高,为(20.69±2.15)%(P<0.05);与包被组的(12.69±1.13)%相比,未包被组的Brd U标记的增殖细胞百分比显著增加,为(35.82±2.11)%(P<0.05);与包被组的(21.77±2.53)%相比,未包被组的Tuj-1阳性细胞百分比显著减少,为(10.67±1.14)%(P<0.05)。结论:未包被FN的体外培养加快了形成神经球的时间,且形态较规则,能较好地维持干细胞自我增殖,减少分化,适宜作为肠神经干细胞体外增殖培养方式。; 刘淼清王永飚黄晓忠朱利斌陈肖鸣李仲荣; 关键词：增殖纤维连接蛋白

P13K／AKT信号通路在一氧化氮对肠神经干细胞增殖分化中的作用被引量：2: 2015年; 目的通过抑制P13K／AKT信号通路，探讨该信号通路在一氧化氮对体外培养的大鼠肠神经干细胞增殖、分化的调控情况。方法从孕15d胚鼠肠道提取肠神经干细胞，传代后的肠神经干细胞分为LY294002（25μmol/L）组、LY294002（50μmol／L）组及空白对照组，培养48h后，形态学观察分析各组的神经球大小情况，流式细胞仪检测各组肠神经干细胞nestin、BrdU标记的增殖细胞、子代细胞神经元Tuj-1染色阳性细胞百分比；传代后的肠神经干细胞分为50〉tool／1DETA／NO＋20ng／mlEGF组、100μmol／LL-NAME＋20ng／mlEGF组及空白对照组（20ng／mlEGF），培养1hA，利用WesternBlot法检测及gel—pro图像软件分析各组P-AKT磷酸化水平。结果形态学观察发现LY294002（50μmol／L）组神经球较小、部分细胞有退化现象、LY294002（25ffmol／L）组次之、空白对照组神经球较大；流式检测发现LY294002（25μmol／L）组与空白对照组相比，肠神经干细胞nestin百分比显著降低[（18．42±1．22）％比（27．44±1．08）％，（P〈0．05）]，BrdU标记的增殖细胞百分比显著降低[（2．20±0．30）％比（12．27±0．59）％，（P〈0．05）]，神经元Tuj-1百分比显著增加[（17．23±0．78）％比（13．98±0．53）％，（P〈0．05）]；而LY294002（50μmol／L）组与空白对照组相比，肠神经干细胞nestin百分比[（8．77±0．90）％比（27．44±1．08）]、BrdU标记的增殖细胞百分比[（0．62±0．03）％比（12．27±0．59）]及神经元百分比[（9．88±i．22）％比（13．98±0．53）％]差异均有统计学意义（P〈0．05）。WesternBlot法检测发现100μmol／LL-NAME＋20ng／mlEGF组P-AKT磷酸化的程度显著增强[（15．71±1．09）％比（39．42±1．02）％，P〈0．053，50μmol／1 DETA／NO＋20ng／mlEGF组显著降低[（58．44±1．73）％比（39．42±1．02）％，P〈0．05]。结论一氧化氮能抑制肠神经干�; 刘淼清胡书奇王永飚黄晓忠朱利斌夏立广李仲荣; 关键词：干细胞细胞分化磷脂酰肌醇3-激酶

先天性巨结肠患儿肠神经干细胞培养的实验研究被引量：6: 2015年; 目的探索从人类先天性巨结肠患儿的扩张段肠管提取肠神经干细胞的可行性，为进一步开展先天性巨结肠的神经干细胞自体移植治疗研究提供依据。方法利用1例先天性巨结肠手术切除的扩张段肠管，进行酶消化后，制成单细胞悬液，经体外培养形成神经球，并通过CCK8法检测肠神经干细胞在24h、48h、72h、96h、120h和144h六个时间点的OD值，绘制生长曲线，记录增殖情况，通过Nestin、GFAP和TUJ-1细胞免疫荧光化学染色对肠神经干细胞及其分化而来的神经元和神经胶质细胞进行鉴定。结果来自扩张段肠管的单细胞悬液通过原代体外培养10d，可见神经球形成；肠神经球随时间逐渐变大，CCK8法观察肠神经干细胞的0D值随时间而逐渐增高；形成的神经球可以继续传代，经细胞免疫荧光化学染色为Nestin染色阳性，并可分化为神经胶质细胞（GFAP染色阳性）和神经元细胞（TUJ-1染色阳性）。结论能从人类先天性巨结肠患儿的扩张段肠管提取具有自我更新能力的肠神经干细胞，可用于先天性巨结肠的神经干细胞自体移植治疗研究。; 胡书奇岳雷夏肇波朱利斌李仲荣; 关键词：干细胞移植

肠与脑来源神经干细胞的增殖和分化特性比较被引量：4: 2011年; 目的探索肠神经干细胞(ENSCs)的增殖和分化特性,寻找神经干细胞移植治疗肠道神经元缺陷性疾病的合适干细胞源。方法采用神经干细胞培养和分离技术,对来自同一大鼠肠道及大脑的神经干细胞(CNS-NSCs)进行体外培养,通过神经球生长直接观察法、CCK-8细胞增殖测定法、流式细胞仪测定,比较研究两者的生长和增殖情况及成熟分化特性。结果与CNS-NSCs相比,ENSCs神经球增殖速度较慢;ENSCs神经球表面常有长突起,并相互连接成网络状,显示早期成熟分化的迹象;CCK-8法测得ENSCs的吸光度明显低于CNS-NSCs(P<0.05),提示其增殖速度慢于CNS-NSCs。流式细胞仪测得EN-SCs和CNS-NSCs的TUJ-1阳性细胞比例分别为12.3%和11.4%(P>0.05)、GFAP阳性细胞比例分别为21.7%和22.5%(P>0.05)、Nestin阳性细胞比例分别为10.8%和10.8%(P>0.05)。结论 ENSCs与CNS-NSCs具有类似的增殖、分化特性,但ENSCs增殖速度较慢,易于成熟分化。; 王永飚朱利斌刘征吉夏立广李仲荣; 关键词：神经干细胞生物学特性

肠和脑来源神经干细胞的nNOS表达研究被引量：1: 2012年; 目的对同一胎鼠的肠神经干细胞和脑神经干细胞进行体外培养,比较两种不同来源神经干细胞的神经型一氧化氮合酶(nNOS)的表达情况。方法从孕20天的SD胚鼠中分别提取肠神经干细胞和脑神经干细胞,采用改良的神经干细胞培养液反复传代。取传代培养6～10天后得到的两种不同来源的神经干细胞球,通过琼脂糖预包埋免疫细胞化学检测法及流式细胞仪检测法测定神经干细胞nNOS的表达。结果通过本实验室改良的神经干细胞培养液及分离方法能培养出两种不同来源的神经干细胞。琼脂糖预包埋免疫细胞化学检测显示,两种不同来源神经干细胞的nNOS表达,分别与相应对照组比较,均有统计学显著性差异(P<0.05),两种不同来源神经干细胞间的nNOS表达比较,也均有统计学显著性差异(P<0.05)。流式细胞仪检测显示,nNOS阳性细胞在肠和脑来源神经干细胞分别占14.13%和5.80%,有统计学显著性差异(P<0.05)。结论两种不同来源的神经干细胞中均有表达nNOS,但消化道来源的肠神经干细胞nNOS表达较中枢神经系统来源的神经干细胞高。; 夏立广黄婷黄晓忠刘淼清王永飚朱利斌李仲荣; 关键词：神经干细胞神经型一氧化氮合酶生物学特性

一氧化氮对大鼠肠神经干细胞增殖与分化的影响被引量：1: 2013年; 目的通过增加外源性一氧化氮或减少内源性一氧化氮，观察一氧化氮对大鼠肠神经干细胞（ENSCs）增殖与分化的影响。方法从孕15d胚鼠肠道提取肠神经干细胞，传代后肠神经干细胞分为DETA／NO50timol／L组、-NAME100p．mol／L组、DETA／N050μmol／L＋L-NAME100／μmol／L组及空白对照组继续培养。培养48h后，硝酸盐还原酶法检测各组培养液中一氧化氮浓度；形态学观察各组神经球大小；流式细胞仪检测各组肠神经干细胞Nestin、BrdU标记的增殖细胞、子代细胞神经元Tuj-1染色阳性细胞百分比及各组细胞的凋亡率。结果与对照组（30．27±18．52）p．mol／L相比，传代培养48h后DETA／NO50umol／L组一氧化氮浓度明显增加（51．94±12．43）umol／L（P〈0．05）、L-NAME100umol／L组明显减少（16．24±12．25）／~mol／L（P〈0．05），DETA／NO50umol／L＋L-NAMEl00~mol／L组无明显差异（38．73±7．95）umol／L（P^0．05）。形态学发现DETA／NO50“mol／L组神经球直径较小，~NAME100p．mol／L组神经球直径较大。流式检测发现DETA／NO50umol／L组肠神经干细胞Nestin百分比（16．57±1．45）％明显降低（P〈0．05），Br（1U标记的增殖细胞百分比（5．33±0．55）％明显降低（P〈0．05），神经元Tuj-1百分比（25．59±2．78）％明显增加（P〈0．05），而L-NAME100／μmol／L组则效应相反，DETA／N050μmol／L＋L_NAME100μmol／L组与对照组无明显差异（P〉0．05）。各组细胞凋亡率无显著性差异。结论DETA／NO在细胞培养液中能分解、释放一氧化氮，可作为合适的外源性一氧化氮的体外供体之一；外源性一氧化氮能抑制肠神经干细胞增殖、促进其向神经元分化，而L-NAME则效应相反。; 刘淼清林正秀张田丰王永飚朱利斌李仲荣; 关键词：神经干细胞一氧化氮细胞增殖细胞分化

肠神经干细胞幽门移植的研究: 2012年; 目的观察大鼠肠神经干细胞（ENSCs）的培养方法，探讨在同种幽门肌移植的可行性。方法从胎龄20d大鼠消化道提取ENSCs，体外培养、扩增及鉴定；PKH-26标记后，注射移植至SD幼鼠幽门肌层，分别在移植术后3d及1、2周切片观察移植细胞的活力及分布。结果提取的细胞经形态学和免疫学鉴定为ENSCs，经流式细胞仪检测β-Ⅲ型微管蛋白（TUJ-1）阳性细胞数为12．3％，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）为21．7％，巢蛋白（Nestin）为10．8％，Ret为1．4％。移植后可以观察到标记细胞在幽门肌层保持正常的细胞形态，随着时间延．长，移植细胞的分布从不规则性转为规则性排列，并有向黏膜下层迁移的迹象。2周后，细胞仍存活良好。结论ENSCs移植后能在受体幽门肌层内存活、迁移。; 朱利斌李仲荣赵艳民刘征吉李东; 关键词：先天性巨结肠

同一胎鼠肠和脑神经干细胞神经递质的表达: 2014年; 目的：观察同一胎鼠肠神经干细胞和脑神经干细胞的神经递质表达情况,探索神经干细胞移植治疗相关疾病的合适干细胞源。方法：从孕20 d的同一SD胚鼠中分别提取肠神经干细胞和脑神经干细胞,采用改良的神经干细胞培养液反复传代,取传代培养6~10 d后得到的2种不同来源的神经细胞球,通过琼脂糖预包埋免疫细胞化学检测法及流式细胞仪检测法测定神经干细胞4种神经递质的表达。结果：2种不同来源的神经干细胞的琼脂糖预包埋免疫细胞化学检测显示：肠神经干细胞神经元型一氧化氮合酶（n NOS）、胆碱乙酰转移酶（Ch AT）与相应的对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;脑神经干细胞n NOS、Ch AT、多巴胺β羟化酶（DβH）与相应的对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;2种不同来源神经干细胞间n NOS、Ch AT比较差异有统计学意义（P〈0.05）。流式细胞仪检测提示：肠神经干细胞γ-氨基丁酸（GABA）、n NOS、Ch AT、DβH阳性细胞合计率分别为1.59%、14.97%、5.43%、1.36%,其中n NOS、Ch AT与相应的同型对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）;而脑神经干细胞GABA、n NOS、Ch AT、DβH阳性细胞合计率分别为1.68%、6.14%、25.42%、9.30%,其中n NOS、Ch AT、DβH与相应的同型对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：肠神经干细胞表达的神经递质主要为一氧化氮（NO）和乙酰胆碱（Ach）,以NO为主;脑神经干细胞表达的神经递质为NO、Ach和去甲肾上腺素（NA）,以Ach为主;2种神经干细胞均无明显表达GABA。; 夏立广李仲荣刘森清王永飚朱利斌赵一鸣; 关键词：神经干细胞神经递质胎鼠

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浙江省自然科学基金(Y207272)

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